Rastreo de compuestos in vivo basado en un modelo espliceosensor en Drosophila

con nuestro modelo espliceosensor. La mayoría de los rastreos de compuestos descritos utilizando D.melanogaster han sido realizados a pequeña escala y de forma manual (Pandey y Nicols, 2011), por lo que mediante este trabajo fuimos los primeros en generar un rastreo de compuestos a gran escala analizando alrededor de 1.000 compuestos químicos diferentes a la semana. Tras la miniaturización y automatización de varios parámetros, establecimos un protocolo final para la búsqueda de compuestos que permite la lectura simultánea de una placa de 96 pocillos (Fig. I9) (Garcia-Alcover et al., 2014). El diseño experimental para el rastreo de compuestos in

vivo consta de placas control así como de placas de ensayo. Las placas control, están

formadas por moscas portadoras únicamente de la construcción minigen:Luc (moscas sanas) no tratadas (alimentadas sólo con DMSO). Estas moscas, además de como control positivo para la calibración de los niveles máximos de luminiscencia, se utilizaron para el cálculo del estadístico z-factor, parámetro que mide la calidad del ensayo (Zang et al., 1999). Cada placa de ensayo está compuesta por 80 pocillos con moscas DM1 tratadas con los compuestos a testar, y 16 pocillos con moscas DM1 sin tratar, utilizadas como control negativo de la medida de los niveles de reportero en ausencia de compuesto. A fin de mantener una robustez estadística óptima, determinamos en 6 el número de réplicas necesarias para cada placa de ensayo.

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Figura I9. Metodología del rastreo de compuestos in vivo basado en las moscas espliosensoras. (A)

Moscas portadoras de la construcción minigen:Luc expresado bajo el control del driver Mhc-Gal4, fueron cruzadas con moscas portadoras de las repeticiones tóxicas (UAS-i(CTG)480) con el fin de obtener

larvas L1 que expresen la construcción minigen:Luc en presencia de las repeticiones tóxicas CUG. (B) Los compuestos y el medio de cultivo de Drosophila se dispensaron en placas de 96 pocillos utilizando un robot dispensador de líquidos. (C) En cada pocillo, se dispensaron 3 larvas L1 utilizando un robot seleccionador de embriones. Cada placa de ensayo se cubrió con una placa de 96 pocillos de mayor profundidad (D). Las placas se incubaron 14 días a 25ºC y posteriormente se congelaron. El número de adultos existente en cada pocillo se contabilizó con la ayuda de un escáner (E). Los adultos se homogeneizaron (F) y se midieron los niveles de luminiscencia de cada lisado con un lector de placas (G). Los resultados obtenidos se dividieron por el número de moscas del pocillo (H). Estos datos se utilizaron para calcular el z-score de cada compuesto de la placa. Figura tomada de Garcia-Alcover et al., 2014

En una primera campaña de screening analizamos la actividad de 16.063 moléculas químicas diferentes evaluando su capacidad para rescatar defectos en el splicing del receptor de la insulina provocados por las repeticiones CTG. La actividad de cada compuesto fue interpretada en función del aumento de los niveles de luminiscencia en nuestras moscas DM1 espliceosensoras y los resultados fueron analizados como valores de z-score (Kreyszig, 1979). A la hora de analizar los resultados, inicialmente medimos la calidad de cada una de las placas de ensayo mediante la determinación del z-factor. Posteriormente medimos el Z-score de cada uno de los compuestos

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incluidos en aquellas placas con z-factor positivo, tomando como positivos aquellos compuestos que estuvieran cerca de triplicar los niveles basales de luminiscencia Finalizado el análisis de los 16.063 compuestos, identificamos 126 compuestos como positivos en el rastreo primario, lo que resultó en un ratio de compuestos positivos del 0,78% (Garcia-Alcover et al., 2014). Dentro de estos compuestos determinados como positivos se encontró la boldina, un compuesto natural de estructura conocida y ampliamente estudiado, que fue seleccionado para su posterior validación además de por su actividad en el rastreo primario, por su estructura común a la de otro compuesto activo identificado en dicho rastreo.

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Objetivos

La Distrofia Miotónica de tipo 1 (DM1), es una enfermedad rara sin un tratamiento efectivo. Los tratamientos disponibles en la actualidad se limitan a fármacos paliativos que alivian parcialmente los diferentes síntomas, sin parar o frenar la progresión de la enfermedad.

Durante la última década, los avances en la comprensión de las alteraciones que suceden a nivel celular al inicio de la enfermedad han permitido abordar nuevas estrategias en la búsqueda de fármacos, tomándose como diana a los diferentes factores identificados e implicados en el mecanismo de patogénesis de la DM1.

En este sentido, en Valentia Biopharma llevamos a cabo un rastreo in vivo de más de 15.000 moléculas químicas diferentes mediante el uso de un modelo de DM1 establecido en Drosophila (moscas espliceosensoras). Este modelo animal reproduce las mismas alteraciones del procesado alternativo de transcritos diana de Muscleblind previamente observadas y caracterizadas en pacientes con esta enfermedad (García- Alcover et al., 2014). A su finalización, nuestra novedosa aproximación nos permitió identificar como compuesto candidato a ser desarrollado como un fármaco para DM1 a la boldina, un alcaloide de origen natural, de estructura conocida y con diferentes propiedades terapéuticas descritas.

Dado el contexto en el que se engloba este trabajo, nos planteamos los siguientes objetivos:

Objetivo 1. Validar la eficacia del alcaloide boldina en modelos en Drosophila, celulares y murinos de DM1.

Objetivo2. Determinar el mecanismo por el cual la boldina reduce la toxicidad asociada a las repeticiones CTG.

Objetivo3. Caracterizar las propiedades farmacológicas y farmacocinéticas de la boldina con el fin de establecer su posible uso como terapia frente a la DM1 en humanos.

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Resultados

1. La boldina, identificada en un rastreo químico in vivo, mejora un fenotipo DM1 en moscas espliceosensoras

Con el fin de identificar nuevas terapias frente a la DM1, diseñamos un novedoso método de rastreo para la búsqueda de compuestos in vivo mediante el uso de nuestras moscas DM1 esplicesensoras (García-Alcover et al., 2014). Para ello, diseñamos una plataforma totalmente automatizada que permite rastreos químicos a gran escala (HTS, por sus siglas en inglés High Throughput Screening) in vivo en placas de 96 pocillos. Tras su utilización por primera vez para la validación de 16.063 pequeñas moléculas procedentes de librerías de compuestos con diferente naturaleza química, se seleccionaron como positivos primarios a aquellas moléculas capaces de producir un aumento en los niveles de luciferasa por encima de tres desviaciones típicas, lo que se traduce en un valor de Z-score de 3 o superior. En un primer ensayo, de los 16.063 compuestos testados se identificaron 126 como positivos (García-Alcover

et al., 2014).

El cabeza de serie de los compuestos identificados en el rastreo primario fue la estefenantrina (García-Alcover, 2015). Con el fin de identificar la región estructural de la estefenantrina responsable de su actividad biológica, en una primera aproximación, buscamos aquellas moléculas con una estructura química similar dentro de las diferentes colecciones de compuestos analizadas en el rastreo primario. Esto permitió la identificación de un segundo compuesto, la boldina, (Fig. R1) cuyo valor de Z-score en el rastreo primario fue de 2.5, lo que la posicionó inicialmente fuera del grupo de compuestos seleccionados como positivos primarios. Dado que el Z-score de la boldina fue cercano al umbral marcado para la determinación de compuestos positivos, y sobre todo, dada su similitud estructural con otro compuesto activo, la boldina fue seleccionada como un compuesto prometedor para su posterior para su posterior validación.

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Figura R1. La boldina es un compuesto estructuralmente similar a la estefenantrina. (A) Estructura

química del compuesto estefenantrina identificado como cabeza de serie en el rastreo primario. (B) Estructura química de la boldina. Las regiones similares de ambas moléculas se muestran con un círculo verde.

Una primera validación de la actividad de la boldina fue comprobar la respuesta de moscas espliceosensoras al tratamiento con boldina de manera individual.

En el rastreo primario, los niveles de luciferasa se normalizaron mediante la división de los valores totales de luciferasa por el número de moscas del pocillo. Teniendo en cuenta que tanto en la musculatura indirecta como en todo el cuerpo de la mosca los niveles de luciferasa podrían aumentar de forma inespecífica y no relativa a la actividad del compuesto, esta metodología podría llevar a la identificación de falsos positivos. Por ello, diseñamos un experimento que nos permitió validar la actividad de la boldina analizando el incremento de los niveles de luciferasa individuales de al menos 8 moscas espliceosensoras portadoras de las repeticiones CTG (MHC-Gal4>UAS-

INSR:Luc#6;UAS-i(CTG)480) tratadas con boldina a la concentración utilizada en el rastreo primario (Fig. R2). Como control, utilizamos moscas del mismo genotipo alimentadas con dimetilsulfóxido (DMSO), solvente en el que se disolvieron los compuestos en el rastreo primario.

Los niveles de luminiscencia obtenidos tras el análisis de moscas individuales tratadas con boldina fueron significativamente mayores a los relativos a moscas alimentadas con DMSO, lo que confirma la actividad de la boldina como tal, eliminando la posibilidad de que fuera un falso positivo.