74 Dímeros y trímeros de ácido ferúlico.
Esquema 3.2. Reacción del ensayo FRAP A es un compuesto antioxidante.
La reacción detecta compuestos con potenciales de reducción menores a 0,7 V, tal que este método es útil para un screening de la capacidad para mantener el estatus redox en células y tejidos. El poder de reducción está relacionado al grado de hidroxilación y conjugación en los polifenoles (Pulido et al., 2000). Este método no detecta compuestos que actúan por transferencia de H, particularmente tioles y proteínas (Prior et al., 2005).
La reacción que tiene lugar en este ensayo es pH dependiente y el aumento de la concentración de Fe2+-TPTZ es linealmente dependiente de la concentración de
antioxidantes presentes en la muestra.
La desventaja que presenta este método es que solo mide la capacidad de reducción del ión férrico, lo cual no es relevante desde el punto de vista fisiológico. No obstante, comparado con otros ensayos, es un método rápido, simple, robusto y económico y no requiere equipamientos muy especializados (Prior et al., 2005).
Procedimiento.
La metodología utilizada en este trabajo fue la descripta por Benzie & Strain (1996) con algunas modificaciones. Diariamente se preparó el reactivo de trabajo, que consiste en una mezcla de buffer acetato 300 mM (NaC2H3O2 – C2H4O2 a pH = 3,6), TPTZ 10 mM en HCl
40 mM y tricloruro férrico (FeCl3.6H2O) 20 mM en una proporción 10:1:1.
Para la determinación de las muestras se colocaron 3 mL de reactivo de trabajo y 95 µL de metanol en un tubo de Khan y se añadieron 5 µL de la FL o FU de los extractos de trigo. La mezcla obtenida se agitó y se dejó reposar a temperatura ambiente por 30 min. Finalmente se midió la absorbancia de la solución a 593 nm (A1) contra un blanco
procesado de la misma forma, de absorbancia A0, en el cual la muestra fue reemplazada por
el solvente de dilución. Todas las muestras y los blancos fueron ensayados por triplicado y se calculó la absorbancia de cada muestra a través de la diferencia (ΔAbs) de A1 - A0.
N N N N N N N N N N N N Fe(III) N N N N N N N N N N N N Fe(II) + A + A.+ Fe3+-TPTZ Fe2+-TPTZ
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La capacidad antioxidante de cada muestra se determinó extrapolando su ΔAbs en una curva de calibración de Trolox. El rango de linealidad utilizado fue de 0 a 20,8 μM y los estándares se procesaron diariamente por triplicado de la misma forma que las muestras.
Los resultados obtenidos se expresaron como mili moles equivalentes de Trolox en 100 g de muestra seca (mmoles ET/100g).
3.2.5. Determinación de la capacidad antioxidante in vivo. Ensayo de sobrevida en la levadura S. cerevisiae.
Se trabajó con una cepa control de levadura S. cerevisiae, la cual se conservó en medio nutritivo líquido YPD (1 % de extracto de levadura, 2 % de peptona y 2 % de glucosa) a – 80°C hasta el momento de su utilización.
En este estudio se evaluó la capacidad de los extractos de trigo, tanto de la FL como de la FU, de atenuar el estrés oxidativo inducido por el oxidante H2O2 en la cepa control de
levadura.
En primer lugar se aclimataron las levaduras en medio YPD por 16 h a 28 ± 2 °C en un agitador orbital de KLINE (VICKING) a 150 rpm. Las levaduras aclimatadas se diluyeron con medio líquido de YPD hasta alcanzar una absorbancia a 600 nm (Abs600nm ) de 0,2-0,3, y
se incubaron por 3 h a 28 ± 2°C con agitación (150 rpm) hasta llegar a fase exponencial de crecimiento (Abs600nm = 0,5-0,7). Luego, se diluyeron nuevamente en medio líquido de YPD
fresco hasta Abs600nm = 0,2. En cada pocillo (well) de una placa de 24 pocillos CELLSTAR de
greiner, se transfirieron 600 μL de la levadura y se evaluaron 4 tratamientos:
I- un control negativo de las levaduras sin ningún tipo de exposición; II- un control de levaduras expuesto a las FL y FU de los extractos; III- un control positivo de levaduras expuestas sólo a H2O2;
IV- exposición de las levaduras a las FL y FU de los extractos más el agregado del H2O2.
El volumen final de cada pocillo fue de 700 μL. En los tratamientos II y IV se agregaron 10 μL de extracto de trigo (FL o FU) incubando por 15 min a 28 ± 2 °C. Inmediatamente se agregó el oxidante (20 μL de H2O2) y se incubó durante 1 h a 28 ± 2 °C
con agitación a 150 rpm. El volumen final (700 μL) en cada pocillo en los 4 tratamientos se alcanzó con el agregado de medio líquido YPD.
Para la evaluación de la sobrevida de la levadura frente a la exposición de oxidante/extracto, el contenido de cada pocillo se diluyó 1000 veces con agua esterilizada en una frasco de 50 mL de color caramelo. Luego se tomaron 80 μL de esta dilución y se sembraron en medio sólido de YPD (YPD con 2 % de agar) incubando durante 72 h a 28 ± 2 °C. Finalmente se realizó el recuento de las colonias expresando los resultados como % de sobrevida, siendo el 100 % de sobrevida el número de colonias observadas en las placas del
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tratamiento I (Baroni et al., 2012). Todos los tratamientos se realizaron por triplicado en una misma placa, y al menos se ensayaron 3 placas por cada tratamiento en distintos días.
La concentración final de H2O2 en cada pocillo fue de 2,5 mM. Esta concentración
permitió un % de sobrevida de la levadura menor al 50 %.
Debido a que el metanol es un solvente orgánico tóxico para la levadura, los extractos se secaron bajo corriente de N2 y se reconstituyeron en DMSO. La concentración
óptima de trabajo de cada extracto se determinó en ensayos previos donde la levadura fue expuesta a distintas concentraciones del mismo. La concentración elegida fue aquella que no resultó citotóxica por sí misma para la levadura y la que mejoró la tasa de sobrevida de las levaduras expuestas al H2O2.
3.2.6. Tratamiento estadístico de los datos.
Los programas utilizados para la interpretación de los resultados generados en esta parte de la tesis fueron el paquete InfoStat (Di Rienzo et al., 2008) y RStudio
Versión 0.98.953 – © 2009-2013 de RStudio, Inc.
Se utilizó el análisis de la varianza para comparar los resultados de capacidad antioxidante en las distintas variedades de trigo analizadas, como así también para las variaciones climáticas (zona y año de cultivo), utilizando el mismo procedimiento que se describió en el Capítulo 1, Sección 1.2.6.
Para estudiar la relación entre el contenido de PT y la capacidad antioxidante del trigo argentino se utilizó el análisis de correlación simple de Pearson (ACSP) (Anexo I,
Sección 1.3.1.1). Para estudiar la relación entre el perfil de compuestos fenólicos y la