Capítulo V Resultados y discusión
3. Tinciones diferenciales de Gram
6.3. Recuento en placa
Se hizo uso del Agar Métodos Estándar (SMA) cuyo fundamento se puede observar en la sección de Anexos, con el título del mismo nombre, con el objetivo de hacer el procedimiento de vertimiento en placa de las diluciones seriadas correspondientes a la muestra experimental en estado inicial dispuesta en medio mineral (MM) con cepas bacterianas provenientes de los aislamientos en BHI de los biorreactores de compost del desarrollo experimental de la fase 1. Estos matraces fueron denominados como MEI 1 y MEI 2 para diferenciarlos de los
biorreactores Muestra 1 y Muestra 2 que son ajenos a este experimento.
Las diluciones seriadas obedecieron al procedimiento explicado en la sección de metodología y más a profundidad en el Anexo 2 del presente documento. Este método permitió llegar a una dilución de x10-8mL, x10-9mL, x10-10mL, para garantizar la contabilidad de colonias al ser vertidas en las placas Petri con el SMA (Medio estandarizado para el conteo bacteriano, como se puede observar en el Anexo 2., SMA), en la siguiente figura se observa el alistamiento de los materiales y sustancias problema.
Figura 81. Ilustración del procedimiento llevado a cabo para el vertimiento en placa de MEI 1 y MEI 2.
En posterior a la incubación durante 24 horas a 36°C±1°C del duplicado de la muestra para las diluciones respectivas ya mencionadas, se hizo uso de un contador de colonias tipo Quebec,
139 (marca O.A. Spencer inc., modelo DGOFO3 l-232-234) para posteriormente reconocer las
Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por mililitro de muestra. Los resultados se expresan en la siguiente tabla:
Tabla 22.
Resultado del conteo bacteriano de la muestra experimental en MM y cepas bacterianas de los biorreactores de composta.
Concentración x10-8mL
MEI 1 MEI 2
Figura 82. Conteo: 244 ⇒ 2.44 x1010 UFC/mL de muestra.
Figura 83. Conteo: 316 (>300, se denominan, por tanto, incontables).
Concentración x10-9mL
140 Figura 84. Conteo: 359 (>300, se denominan, por
tanto, incontables).
Figura 85. Conteo: 185. ⇒ 1.85 x1011 UFC/mL de muestra.
Concentración x10-10mL
MEI 1 MEI 2
Figura 86. Conteo: 199 ⇒ 1.99 x1012 UFC/mL de muestra.
Figura 87. Conteo: 231 ⇒ 2.31 x1012 UFC/mL de muestra.
Fuente: elaboración propia.
Debido al carácter “incontable” de las algunas de las colonias correspondientes a las diluciones de x10-8y x10-9, y que en ambos conteos surgió en la dilución x10-10, el análisis corresponde a que solo en esta dilución queda en el parámetro confiable, es decir, para el
duplicado del procedimiento resultan 1.99 x1012 UFC/mL y 2.31 x1012 UFC/mL de muestra, que en promedio corresponde a 2.15 x1012 UFC/mL.
Importancia de las UFC en el estado inicial de la muestra. Conocer la cantidad de colonias que pueden formarse y estar presentes en una muestra, puede ser importante para cumplir con los estándares de la normatividad en cuanto al desarrollo bacteriano en el área de la producción de alimentos, áreas de la salud, análisis de agua, aire, el suelo y otros medios (Erika Sánchez, Núñez, Cruz, Torres, & Herrera, 2017); ya que el método de recuento en placa, a pesar de ser una metodología convencional y antigua, tiene un límite de detección adecuado debido a que arroja un resultado de las células o vivas de la muestra estudiada, lo que lo hace deseable.
141 Debido a lo precitado, se sustenta la razón por la cual se hizo uso de este método y por qué se busca conocer la cantidad de colonias viables en la muestra, lo que puede ser complementado con mencionar que al ser una muestra con polímeros de origen orgánico es bastante entendible que si bien al elaborar el plástico de XgT se buscó una esterilización, cuando esta se somete a un sistema con medio mineral y cepas bacterianas, se busca, además de analizar la degradabilidad de la muestra en medio líquido para hacer comparación con los ya trabajados sistemas de
composteo, poder contar con la factibilidad de desarrollo bacteriano con el bioplástico o muestra experimental como fuente de carbono o energía para las comunidades bacterianas.
Ahora bien, en este estudio se reconoce que la viabilidad, es decir, la capacidad de los microorganismos para multiplicarse en un medio sólido formando una colonia (Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco, 2017), como un aspecto importante a evaluar, ya que con este es posible analizar tanto el comportamiento de las bacterias existentes en el sistema de composteo trabajado en el experimento de la primera fase, como la capacidad del plástico de XgT al ser fuente de carbono en un sistema líquido de dar paso al desarrollo bacteriano, ya que la adhesión bacteriana, la formación de biopelículas en superficies o líquidos con componentes que pueden ser nutrientes de estas, tienen una gran relevancia dado el grado de deterioro o
degradación que generan (UNPSJB, 2017).
En base a lo anterior, es posible comprender que el haber obtenido una densidad bacteriana de 2.15 x1012 UFC/mL de muestra, después de 24 horas de incubación (factor importante a tener en cuenta) con el SMA como medio de cultivo (que permite el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos), es decir, habiéndose permitido el desarrollo de la mayor cantidad de bacterias, corresponde a un valor de viabilidad alto, ya que, al comparar con estudios de
142 Chaparro, 2011), los autores aseguran que su mayor tasa de crecimiento bacteriano a las 24h fue de 2x1012 UFC/mL en producción de inoculantes por fermentación sumergida.
Algunos estudios llevados a cabo propiamente en producción de biofilms bacterianos en plásticos convencionales muestran valores de crecimiento mucho menores, como en la
investigación de (Fernández, 2016) la cual exhibió que el desarrollo bacteriano en muestras de estos residuos en el océano tuvo como mayor valor 2.56x104 UFC/mL, lo cual, en comparación con este estudio, puede deberse tanto a los nutrientes difícilmente aprovechables de los plásticos petroquímicos, como a las grandes áreas que se requiere para conformar el biofilm. Otro espacio de análisis pueden ser las ‘formulaciones de bacterias’, ya que estos se encuentran en el mercado como alternativas viables para el desarrollo bacteriano funcional, en el caso que se expone, para control de algas en tanques; el producto de (Agro Q-tral, 2019), exhibe un consorcio de bacterias facultativas del género Bacillus de 2x1012 UFC/mL, una tasa adecuada según la empresa.
Por tales motivos, se puede confirmar que la producción o desarrollo bacteriano cuando la muestra proviene de plástico de xiloglucano de tamarindo y acrilato de etilo (la muestra
experimental de este estudio, específicamente en estado inicial), puesta en un sistema con medio mineral y cepa bacteriana de 100μL (proveniente de los aislamientos secundarios en BHI), de distintas especies, es adecuada y genera una densidad bacteriana alta con respecto a resultados de inoculación o estimación de crecimiento bacteriano en procesos similares a los de esta
investigación.
7. Actividad bacteriana muestra experimental estado inicial
Para conocer la actividad microbiana que posiblemente existía en la muestra experimental (plástico de XgT con acrilato de etilo) en su estado inicial, se hizo la siembra respectiva en BHI, en donde se obtuvo lo que se muestra en la siguiente figura, lo que corresponde a un único
143 aislamiento de microorganismos por lo que se pudieron evidenciar diferentes morfologías.
Posteriormente, se extrajo una pequeña fracción y se hizo la Tinción diferencial de Gram para lo cual se obtuvo morfología de bacilos Gram negativos.
Figura 88. (Izq.). Siembra en BHI del estado inicial de la muestra. (Der). Tinción diferencial de Gram. Como es posible observar, en la siembra por agotamiento en cinco fases de la muestra se observa un estado inicial con cerca de 6 morfologías coloniales distintas (debido a la ausencia de un aislamiento previo), por lo que puede afirmarse que varias especies bacterianas se
encontraban en el plástico de XgT, lo que pudo deberse por la exposición de este al medio circundante cuando se manipulaba para extraer las fracciones requeridas para el montaje de los sistemas de compostaje y de la evaluación cualitativa con reconteo en placa, y que estas se desarrollaran o se encontraran en estado latente ‘adheridas’ a la muestra a lo largo de todo el procedimiento experimental.
Lo anterior, se confirma debido a que, las bacterias, en especial las anaerobias están dispersas en la naturaleza, particularmente haciendo parte de la flora normal de las mucosas, piel, boca, vías aéreas superiores, por lo que el ser humano llega a poseer hasta 100 especies distintas de microorganismos y en su interior albergar hasta 100 trillones (Solano, 2018), por lo que fue posible si bien una contaminación por manipulación, o propiamente el hecho común de que en
144 los ambientes naturales, cerca del 99% de las células bacterianas que existen están adheridas o formando biofilms en las superficies (Ríos, 2013).
8. Actividad enzimática en los sistemas de composteo
Luego de la siembra con asas plásticas, en este caso de marca Difco Laboratories, de volumen conocido de 1μL de dilución de del contenido de cada biorreactor (control positivo, control negativo, muestra 1 y muestra 2) con su respectiva turbidez de referencia, se obtuvo: Tabla 23.
Perfil enzimático del contenido de los biorreactores de la Primera Fase, toma de CO2 muestral.
Nombre
biorreactor AA BP LD
Control (+)
Figura 89. Control (+) en AA. Desarrollo: sí. Resultado: (-).
Figura 90. Control (+) en BP. Desarrollo: no. Resultado: (-).
Figura 91. Control (+) en LD. Desarrollo: no. Resultado: (-).
Control (-)
Figura 92. Control (-) en AA. Desarrollo: sí. Resultado: (-)12.
Figura 93. Control (-) en BP. Desarrollo: no. Resultado: (-).
Figura 94. Control (-) en LD Desarrollo: sí. Resultado: (+).
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Muestra 1
Figura 95. Muestra 1 en AA. Desarrollo: sí. Resultado: (+). Figura 96. Muestra 1 en BP. Desarrollo: sí. Resultado: (+). Figura 97. Muestra 1 en LD. Desarrollo: sí. Resultado: (+). Muestra 2
Figura 98. Muestra 2 en AA. Desarrollo: sí. Resultado: (+).
Figura 99. Muestra 2 en BP. Desarrollo: sí. Resultado: (+).
Figura 100. Muestra 2 en LD. Desarrollo: sí. Resultado: (+).
Fuente: Elaboración propia
Conforme a estos resultados, se puede evidenciar que, aunque en algunas de las bacterias aisladas en la siembra secundaria en BHI de los biorreactores de la muestra 1 y 2 –M1 y M2- (ver 2. Siembra secundaria y 3. Perfil enzimático, de este capítulo), al realizarles el perfil enzimático de amilasa, caseinasa y lecitinasa arrojaron resultados negativos, para este caso, sin aislamiento previo, se observan resultados positivos para las tres enzimas, lo cual puede deberse a que si bien la actividad no corresponde a la producción de estas enzimas de estudio o la bacteria requiere exoenzimas para ‘habilitarla’, cuando existen varias especies en el medio, se pueden permitir estas condiciones o simplemente poseer las enzimas.
También, se tiene en cuenta que las bacterias termófilas (en el estudio estuvieron a 58°C), poseen variedad enzimas (además de membranas especializadas) que les permiten hacer sus
146 procesos funcionales, se reconoce en ellas la existencia de amilasas, entre otras, por lo que tienen potencial de aplicaciones industriales (Elena Sánchez, n.d.), como podría ser su utilización para degradar polímeros. Por otro lado, se observan morfologías coloniales completamente distintas al comparar los medios AA, LD, BP, respectivamente de M1 y M2.
En cuanto al control positivo, es decir, la muestra que se sembró a partir del biorreactor de compost y celulosa, se evidenció un resultado negativo tanto para amilasa, caseinasa y lecitinasa, resultado similar al control negativo (del biorreactor con compost y polietileno (PE)), sin embargo, este presentó lecitinasa positiva, lo que puede deberse a la actividad de algunos microrganismos que ya se encontraban presentes en el inóculo de compost en estado de maduración (Román et al., 2015), que debido a su desarrollo lento por no tener suficientes fuentes de carbono al no poder degradar el PE pudieron encontrarse presentes en estado latente al agotarlas. La otra posibilidad es un error sistemático, pues a pesar de utilizar distintas asas en cada siembra, pudo haber contaminación del medio.
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Capítulo VI