Recuentos microbianos en Agar TCBS, con relación a los brotes de WSSV.

Estanque 744

Los recuentos de bacterias totales (Sucrosa (+) mas Sucrosa (1)) en agar TCBS en el estanque 744 mostraron relación con brotes de mancha blanca en los muestreos 4, 5 y 10. En el muestreo 4 efectuado tres días después del brote, el promedio de los recuentos fue de 5 x 103 UFC/mL; en el muestreo 5, tres días antes del siguiente brote, el promedio de los recuentos fue de 3.8 x 102 UFC/mL; y en el muestreo 10, un día después del último brote, el promedio de los recuentos fue de 2.4 x 101 UFC/mL. Por otro lado los promedios de recuentos no asociados con brotes y diferentes a los obtenidos en el primer y el último muestreo, presentaron un rango amplio entre 0 UFC/mL hasta 5.5 x 103 UFC/mL. Los promedios de recuentos anteriores a la primera aparición de brote (muestreo 1 y 2) fueron de 0UFC/mL en los dos casos; luego del último brote (muestreo 11), el promedio de los recuentos fue de 6.9 x 103 UFC/mL. El promedio general de todos los recuentos durante las 11 semanas de muestreo fue de 5.5 x 102 UFC/mL para este estanque (Anexo 6.g)

En este estanque se presentó una prevalencia del 7 % de camarones con presencia de bacterias sucrosa positiva, con un recuento total a lo largo del estudio de de 9 x 104 UFC/mL y un recuento promedio de 5.5 x 102 UFC/mL, siendo estos datos mayores a los de bacterias sucrosa negativa ya que la prevalencia fue del 4% con un recuento total de 1.9 x 103 UFC/mL y un recuento promedio de 1.1 x 10 UFC/mL. (Anexo 6.t)

Estanque 745

Los recuentos de bacterias totales (Sucrosa (+) mas Sucrosa (1)) en agar TCBS en el estanque 745 mostraron relación con brotes de mancha blanca en los muestreos 1, 3, 6 y 9. En el muestreo 1 efectuado durante un brote agudo, el promedio de los recuentos fue de 3.9 x 102 UFC/mL; en el muestreo 3 el cual se realizó un día antes del siguiente brote , el promedio de los recuentos fue de 9.2 x 103 UFC/mL; en el muestreo 6, el cual fue durante el segundo brote agudo, evidenció un promedio de los recuentos de 4 x 103 UFC/mL; y en el muestreo 9, al final del último brote, el promedio de los recuentos fue de 5.1 x 103 UFC/mL. Por otro lado los promedios de recuentos no asociados con brotes y diferentes a los obtenidos en el primer y el último muestreo, presentaron un rango entre 0 UFC/mL hasta 2.1 x 102 UFC/mL. Luego del último brote (muestreo 11), el promedio de los recuentos fue de 1.6 x 102 UFC/mL. El promedio general de todos los recuentos durante las 11 semanas de muestreo fue de 1.8 x 103 UFC/mL para este estanque. (Anexo 6.i)

En este estanque se presentó una prevalencia del 12 % de camarones con presencia de bacterias sucrosa positiva, con un recuento total a lo largo del estudio de de 8.5 x 104 UFC/mL y un recuento promedio de 5.2 x 102 UFC/mL; en el caso de bacterias sucrosa negativa se presento una prevalencia del 7% pero con un recuento total mayor al de bacterias sucrosa positiva de 2 x 105 UFC/mL y un recuento promedio de 1.2 x 103 UFC/mL. (Anexo 6.u)

Estanque 746

Los recuentos de bacterias totales (Sucrosa (+) mas Sucrosa (1)) en agar TCBS en el estanque 746 mostraron relación con brotes de mancha blanca en los muestreos 6, 7 y 10. En el muestreo 6 efectuado durante un brote agudo, el promedio de los recuentos fue de 2.7 x 102 UFC/mL; en el muestreo 7 el cual se realizó tres días después del mismo brote, el promedio de los recuentos fue de 4.5 x 103 UFC/mL; en el muestreo 10, el cual fue 4 días antes del último brote, evidenció un promedio de los recuentos de 1.1 x 103 UFC/mL. Por otro lado los promedios de recuentos no asociados con brotes y diferentes a los obtenidos en el primer y el último muestreo,

presentaron un rango amplio fluctuando entre 0 UFC/mL hasta 8.8 x 102 UFC/mL. Los promedios de recuentos anteriores a la primera aparición de brote (muestreo 1, 2 y 3) fue de 0UFC/mL en los tres casos. Luego del último brote (muestreo 11), el promedio de los recuentos fue de 3 x 102 UFC/mL. El promedio general de todos los recuentos durante las 11 semanas de muestreo fue de 6.6 x 10 UFC/mL para este estanque. (Anexo 6.j)

En este estanque la prevalencia de camarones con crecimiento de bacterias sucrosa positiva fue del 10%, con un recuento total de 9.8 x 104 UFC/mL y un promedio de 5.9 x 102 UFC/mL, a diferencia de las bacterias sucrosa negativa que presentaron una menor prevalencia 7% en los camarones evaluados con un menor recuento total de 9.9 x 103 UFC/mL y un promedio de 6 x 101 UFC/mL (Anexo 6.v)

Estanque 747

Los recuentos de bacterias totales (Sucrosa (+) mas Sucrosa (1)) en agar TCBS en el estanque 747 mostraron relación con brotes de mancha blanca en los muestreos 3, 4, 5, y 6. En el muestreo 3 efectuado durante el primer brote, el promedio de los recuentos fue de 7.2 x 103 UFC/mL; en el muestreo 4 el realizado un día después del mismo brote, el promedio de los recuentos fue de 7.3 x 102 UFC/mL; en el siguiente muestreo, el cual fue 4 días antes del siguiente brote, evidenció un promedio de los recuentos de 3.9 x 103 UFC/mL y en el muestreo 6, realizado al finalizar este mismo brote, el promedio de los recuentos fue de 3.3 x 102 UFC/mL. Por otro lado los promedios de recuentos no asociados con brotes y diferentes a los obtenidos en el primer y el último muestreo, presentaron un rango entre 0 UFC/mL hasta 6 x 101 UFC/mL. El promedio de recuentos anterior a la primera aparición de brote (muestreo 1y 2) fue de 4.9 x 103 UFC/mL y 1.1 x 101 UFC/mL respectivamente. Luego del último brote (muestreo 11), el promedio de los recuentos fue de 0 UFC/mL. El promedio general de todos los recuentos durante las 11 semanas de muestreo fue de 1.6 x 103 UFC/mL para este estanque. (Anexo 6.k)

En este estanque se dio una prevalencia del 8% camarones con presencia de bacterias sucrosa positiva con un recuento total de 1.9 x 105 UFC/mL y un promedio de 1.2 x

103 UFC/mL, siendo estos datos mayores a los relacionados con bacterias sucrosa negativa que presentaron una prevalencia del 2% con un recuento total de 6.7 x 104

UFC/mL y un promedio de 4.1 x 102 UFC/mL (Anexo 6.w)

Estanque 748

Los recuentos de bacterias totales (Sucrosa (+) mas Sucrosa (1)) en agar TCBS en el estanque 748 mostraron relación con brotes de mancha blanca en los muestreos 3 y 6. En el muestreo 3 efectuado tres días antes del primer brote, el promedio de los recuentos fue de 9.1 x 103 UFC/mL; en el muestreo 6 el realizado durante un brote agudo, el promedio de los recuentos fue de 3 x 102 UFC/mL. Por otro lado los promedios de recuentos no asociados con brotes y diferentes a los obtenidos en el primer y el último muestreo, presentaron un rango amplio entre 0 UFC/mL hasta 1.7 x 103 UFC/mL. El promedio de recuentos anterior a la primera aparición de brote (muestreo 1y 2) fue de 3.7 x 103 UFC/mL y 0 UFC/mL respectivamente. Luego del último brote (muestreo 11), el promedio de los recuentos fue de 0 UFC/mL. El promedio general de todos los recuentos durante las 11 semanas de muestreo fue de 1.6 x 103 UFC/mL para este estanque. (Anexo 6.l)

En el caso de este estanque se dio una prevalencia del 9% de los camarones evaluados con crecimiento de bacterias sucrosa positiva, teniendo estas un recuento total de 1.3 x 105 UFC/mL un promedio de 8.2 x 102 UFC/mL, siendo la aparición de estas mayor a las bacterias sucrosa negativas que tuvieron una prevalencia del 6% con un recuento total de 9x 104 UFC/mL y un promedio de 5.5 x 102 UFC/mL. (Anexo 6.x)

Estanque 749

Los recuentos de bacterias totales (Sucrosa (+) mas Sucrosa (1)) en agar TCBS en el estanque 749 mostraron relación con brotes de mancha blanca en los muestreos 4 y 6. En el muestreo 4 efectuado tres días después del primer brote, el promedio de los recuentos fue de 3.6 x 103 UFC/mL; en el muestreo 6 realizado durante un brote agudo, el promedio de los recuentos fue de 3 x 102 UFC/mL. Por otro lado los promedios de recuentos no asociados con brotes y diferentes a los obtenidos en el

primer y el último muestreo, presentaron un rango amplio entre 0 UFC/mL hasta 6.6 x 102 UFC/mL. El promedio de recuentos anterior a la primera aparición de brote (muestreo 1y 2) fue de 0 UFC/mL y 2.8 x 102 UFC/mL respectivamente. Luego del último brote, en el último muestreo (muestreo 11), el promedio de los recuentos fue de 0UFC/mL. El promedio general de todos los recuentos durante las 11 semanas de muestreo fue de 4.5 x 102 UFC/mL para este estanque. (Anexo 6.m)

En este estanque la aparición de bacterias sucrosa positiva y sucrosa negativo fue bastante parecida, presentando recuentos totales de 4.1 x 104 UFC/mL (promedio 2.5 x 102 UFC/mL) y 3.4x 104 UFC/mL (promedio 2.1 x 102 UFC/mL) respectivamente, pero con una prevalencia de 7% de camarones evaluados con crecimiento de sucrosa positiva y 3% con crecimiento de sucrosa negativa. (Anexo 6.y)

Cabe resaltar que a lo largo de todo el estudio y en todos los estanques se dio una prevalencia mayor de bacterias sucrosa positiva (9%) sobre las sucrosa negativas (5%) en el total de los camarones evaluados (984 camarones), pero en el caso de los recuentos se obtuvieron valores cercanos con promedios de 6.5 x 102 UFC/mL para bacterias sucrosa positiva y 4.1 x 102 UFC/mL para bacterias sucrosa negativas. (Anexo 6.a.a)

Los resultados obtenidos de los análisis microbiológicos, en lo que se refiere a bacterias heterótrofas totales crecidas en agar marino (mayoría de bacterias presentes en los camarones), alcanzaron valores elevados siendo estos más altos que los obtenidos en las siembras de agar TCBS. Sin embargo, tomando en cuenta que este es un agar no selectivo los recuentos incluyen tanto bacterias patógenas como las que no lo son; esto puede restarle importancia al elevado recuento; pero basándose en reportes de Gómez1Gil, B. 2008, los recuentos en agar marino mayores a 105 UFC/mL son severos, los que están entre 104 y 103 UFC/mL se interpretan como elevados y los que son menores a 103 son normales; considerando que del 10 al 20 % de la muestra deben ser vibrios (microorganismos potencialmente patógenos para el camarón).

Según esta interpretación existe en este estudio un grado elevado en los recuentos obtenidos de la siembra de hemolinfa en agar marino, ya que en promedio los valores se encuentran entre 104 y 103 UFC/mL.

Con respecto al comportamiento de los recuentos en agar TCBS, se consideran valores de recuentos más bajos, ya que la siembra en este medio hace posible el aislamiento y recuento de microorganismos potencialmente patógenos para el camarón, por ser altamente selectivo para bacterias marinas principalmente de la

familia , aunque también crecen especies bacterianas de los géneros

+ ! y enterobacterias. En la

siguiente tabla se muestra la forma de interpretación de los resultados:

Tabla 8. Interpretación de resultados de crecimientos bacterianos en agar TCBS en camarones juveniles y adultos (Adaptado de Gómez1Gil 2006)

Tipos de UFCs Hemolinfa >103 <103 Hepatopáncreas >105 <105

Verdes >50% Serio Elevado1Serio Serio Elevado1Serio

Verdes <50% Elevado1Serio Serio Elevado Normal1Elevado

Amarillas Elevado Elevado Normal1Elevado Normal

Según la anterior descripción, los promedios de recuentos en agar TCBS, obtenidos a partir de la hemolinfa de los camarones evaluados en el presente estudio, se interpretaron como serios y elevados, ya que los promedios de recuentos fueron de 103 UFC/mL.

Como se pudo observar en la descripción del comportamiento de los recuentos bacterianos totales en agar marino, para cada estanque, la relación entre el aumento de estos recuentos y la presencia de brotes de WSSV, se dio en todas las ocasiones, justificándose este resultado en la aparición de recuentos elevados durante los brotes

y/o pocos días antes o después del episodio de brote (promedios de recuentos entre 104 y 103 UFC/mL para todos los casos relacionados con brote), de igual forma se pudo observar que en agar TCBS los recuentos relacionados con brotes de WSSV también fueron de carácter elevado. Este resultado puede atribuirse a que las bacterias

principalmente del género , son consideradas como patógenos oportunistas, ya

que en presencia de otros factores estresantes, como lo es el estrés causado por otra enfermedad, pueden ser un factor determinante en la patogénesis de enfermedades

virales (Lightner, D.V., . 1983), desencadenando un aumento en su número o la

proliferación de patógenos nocivos dando como resultado mortalidades en los organismos de cultivo (Morales1Covarrubias. : Morales, V. y J. Cuéllar1Anjel (eds), 2008).

De forma general los recuentos promedios por camaron obtenidos de los siembras realizadas en agar marino mostraron que en las semanas con brote los promedios de los recuentos por camaron fueron 1,3 veces mayores a los promedios de los recuentos obtenidos en los camarones muestrados durante las semanas sin brote.

En el caso de las siembras en agar TCBS se observó una diferencia más marcada, teniendo promedios de los recuentos por camarón, 2,8 veces mayores en las semanas con brote en comparación con los promedios de los recuentos obtenidos a partir de los camarones muestreados en las semanas sin brote, este resultado fue del total de las bacterias creciadas en este medio; de manera mas especifica los recuentos promedio de sucrosa positivas fueron 3,1 mayores en las semanas con brote que los obtenidos en las semanas sin brote y los recuentos promedio de sucrosa negativas fueron 1,4 mayores en las semanas con brote que los obtenidos en las semanas sin brote.(Para mayor información el la tabla del Anexo se resumen todos los promedios de los recuentos por estanque y por semana)

Aunque los invertebrados marinos están en constante contacto, en su ambiente natural, con una gran diversidad de microorganismos (múltiples virus y bacterias) estos pueden contribuir una seria amenaza a su sobrevivencia, no obstante a pesar de

que los camarones poseen un sistema inmune primario (sólo sistema inmune innato, a diferencia de los vertebrados que además poseen un sistema adaptativo), este sistema se considera eficiente y capaz de protegerlos contra la invasión de los agentes causantes de enfermedades (Barroco, M. et al. Morales, V. y J.Cuellar1Anjel (eds).2008).

Relacionando la anterior afirmación con los resultados de este estudio, se debe resaltar que además en condiciones de cultivo (sobre todo en forma intensiva o semi1 intensiva), los patógenos pueden dejar de comportarse como enzoóticos (manteniendo una prevalencia estable dentro de una población y dentro de un área dada) cuando se encuentran bajo condiciones normales; y que por el contrario tiendan a comportarse como epizoóticos (enfermedad contagiosa que ataca a gran número de animales a un mismo tiempo, abarca áreas grandes y se propaga con mucha rapidez) cuando el camarón es sujeto a cultivo donde factores inherentes, como lo son las alteraciones de uno o mas agentes tales como: calidad del agua, niveles de oxígeno, temperatura, salinidad, presencia de contaminantes, alta densidad poblacional, nutrición inadecuada, etc.; crean las condiciones de estrés en las que se inician una o más enfermedades (Sindermann, C. J. (Ed). 1977). Con esta afirmación se puede dar explicación a los valores, considerados como serios y elevados, de los recuentos bacterianos de hemolinfa tanto en agar TCBS y agar marino.

Esto deja clara la importancia de mantener los parámetros óptimos, la aplicación correcta de la alimentación y el mantenimiento del florecimiento de algas para una buena calidad de aguas y de los fondos de los estanques, y de esta forma obtener un equilibrio en la población microbiana en el sistema de cultivo (Morales1Covarrubias.

: Morales, V. y J. Cuéllar1Anjel (eds), 2008).

Todas las manifestaciones de los resultados (recuentos bacterianos), se pueden observar en las gráficas anexadas de promedios consolidados de recuentos

bacterianos por estanque por semana, tanto en agar marino como en agar TCBS (Anexo 6).