Recuentos microbianos en Agar TCBS, con relación a los signos clínicos

En el caso de las siembras en agar TCBS se determinó que de los camarones sin signos clínicos, 81 camarones presentaron bacteremia (8% del total de camarones evaluados) con un promedio de los recuentos de 3.7 x 102 UFC/mL de sucrosa positivas y 1.7 x 102 UFC/mL de sucrosa negativas (5.0 x 102 UFC/mL bacterias totales en TCBS); de los camarones con otros signos clínicos 8 camarones presentaron bacteremia (1% del total de camarones evaluados), con un promedio de los recuentos de 1.6 x 101 UFC/mL de sucrosa positivas y 7.5 x 1011 UFC/mL de sucrosa negativas (1.9 x 101 UFC/mL bacterias totales en TCBS); en el caso de los camarones con WSSV, 19 camarones presentaron crecimiento de bacterias con un promedio de los recuentos de 3.1 x 102 UFC/mL de sucrosa positivas y 1.9 x 102 UFC/mL de sucrosa negativas (5 x 102 UFC/mL bacterias totales). Esta distribución se observa en la siguiente gráfica.

Figura 24. Gráfica de Distribución consolidada de recuentos bacterianos promedio en Agar TCBS con relación a los signos clínicos.

3,7E+02 2,0E+02 1,5E+02 6,4E+00 7,0E+03 2,3E+03 0,0E+00 1,0E+03 2,0E+03 3,0E+03 4,0E+03 5,0E+03 6,0E+03 7,0E+03 8,0E+03 9,0E+03 1,0E+04 U F C /m L

Distribución consolidada de re cue ntos bacte rianos prome dio e n agar TCBS con re lación a los Signos clínicos

Sucrosa (+) Sucrosa (1)

sin signos clínicos otros signos clínicos WSSV (n=984)

8%

1%

La distribución consolidada de los recuentos bacterianos promedio en agar TCBS, discriminados por estanque y según la presencia o no de signos clínicos se expresa en las gráficas (Anexo 6.a.c, 6.a.d, 6.a.e )

En la siguiente tabla se puede observar de forma resumida el comportamiento de los recuentos en agar TCBS, según la aparición de signos clínicos, indicando los valores totales, promedio, máximos y mínimos, de los crecimientos bacterianos obtenidos a partir de la hemolinfa de los camarones muestreados durante el estudio.

Tabla 10. Recuentos en Agar TCBS según los signos clínicos

Comportamiento de los Recuentos (UFC/mL) en Agar TCBS

Sin signos Clínicos

Suc (+) Suc (A) Totales

Promedio 3,9E+02 2,5E+02 6,3E+02

Total 3,3E+05 2,1E+05 5,3E+05

Máximo 1,1E+05 5,5E+04 1,4E+05

Mínimo 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00

n 840 840 840

Con otros Signos Clínicos

Suc (+) Suc (A) Totales

Promedio 1,7E+02 6,9E+00 1,8E+02

Total 1,8E+04 7,4E+02 1,9E+04

Máximo 1,1E+04 5,9E+02 1,1E+04

Mínimo 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00

n 107 107 107

Con WSSV

Suc (+) Suc (A) Totales

Promedio 7,8E+03 5,0E+03 1,3E+04

Total 3,0E+05 2,0E+05 5,0E+05

Máximo 7,5E+04 1,2E+05 1,2E+05

Mínimo 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00

La estadística aplicada a los recuentos obtenidos en agar TCBS, con relación a la evaluación de signos clínicos en los camarones examinados, arrojó resultados similares, en cuanto a su comportamiento, a los obtenidos en agar Marino, es decir, que en los camarones con WSSV los recuentos de bacterias crecidas en TCBS ( Totales: log(x+1) 1.7447, Sucrosa positiva: log(x+1) 1.5041 y Sucrosa negativa: log(x+1) 0.7211, 39); fueron significativamente mayores a los recuentos en camarones sin signos clínicos (Totales: log(x+1) 0.2824, Sucrosa positiva: log(x+1) 0.2202 y Sucrosa negativa: log(x+1) 0.1259, n= 839) y a los recuentos en camarones con otros signos clínicos (Totales: log(x+1) 0.2066, Sucrosa positiva: log(x+1) 0.1776 y Sucrosa negativa: log(x+1) 0.0598, n= 107), pero no existieron diferencias significativas entre los recuentos de los dos últimos grupos mencionados. ( ≤ 0.0001)

También se pudieron evidenciar diferencias significativas en los recuentos de bacterias totales crecidas en agar TCBS (sucrosa positivas mas sucrosas negativas), en cuanto a las semanas y la presencia o no de signos clínicos y de WSSV.

Específicamente, se presentaron diferencias significativas en los recuentos de los camarones con WSSV, entre semanas de muestreo (11), los valores mas elevados fueron en las semanas: 6, 3 y 1 ( entre estas 3 semanas no hubo diferencias significativas), siendo estos valores significativamente mayores a los de las semanas: 7, 4 y 5; en los recuentos de camarones sin signos clínicos, si hubo diferencias significativas entre las semanas de muestreo, el recuento de la semana 9 fue significativamente mas alto que el resto de las semanas (las semanas: 7, 6, 11, 3 1 y 5 tuvieron recuentos significativamente mayores a las semanas: 4, 2, 8 y 10); en cuanto a los recuentos de los camarones con otros signos cínicos, los valores mas altos fueron los de las semanas: 9, 4, 6 y 11 ( entre estas 4 semanas no hubo diferencias significativas), siendo estos recuentos significativamente mayores a los de las semanas restantes ( ≤ 0.0001) (Anexo 7)

Los valores promedio de los recuentos en agar TCBS fueron más bajos que los hallados en agar marino, debido a que el medio TCBS es altamente selectivo (especialmente género vibrio).

Esta información obtenida a partir de la aplicación estadística (ANOVA y Duncan) sobre los recuentos en relación a los signos clínicos aparecidos en los camarones examinados a lo largo del estudio, es homóloga al comportamiento de los recuentos con relación a la aparición de brotes en los estanques de cultivo, tanto en agar marino como en agar TCBS, ya que de igual forma los recuentos se ven incrementados en presencia de la enfermedad de WSSV, en comparación con aquellos recuentos obtenidos de camarones sin evidencia de signos clínicos y de camarones con otros signos clínicos diferentes a los característicos de WSSV.

Igualmente esta idea de coinfección o vínculo entre las enfermedades, la cual aparece cada vez más claramente delineada, es la que causa que uno de los dos patógenos se incremente debido al estrés que genera la acción de la primera enfermedad, la penetración de este primer patógeno en el hospedero generan una serie de reacciones inmunológicas complejas con el objetivo de neutralizar y eliminar los agentes invasores; cuando este cuerpo extraño logra evadir la línea de defensa inicial (exoesqueleto, tracto digestivo revestido por quitina y enzimas inactivadotas), en la hemolinfa, se activan las respuestas inmuno celulares y humorales (Barroco, M. et al.

Morales, V. y J. Cuellar1Anjel (eds).2008).

Lo que se describe anteriormente, puede coincidir con condiciones ambientales subóptimas (frecuentes en cultivo), como ocurre en la mayoría de los casos, extendiendo las respuestas adaptativas del camarón más allá de sus posibilidades, provocando un desgaste excesivo del organismo, hecho que es aprovechado por las bacterias oportunistas (Gómez, B. Páez1Osuna F. 2003 Editor). Toda esta interacción compleja entre huésped – patógeno y ambiente es lo que desencadena la enfermedad.

Como se menciono anteriormente los recuentos obtenidos de las muestras de hemolinfa de los camarones incluidos en los otros dos grupos (sin signos y con otros signos), fueron significativamente menores a los recuentos obtenidos de camarones con WSSV; esto puede explicar que los camarones supuestamente libres de enfermedad ejecutaron con mayor eficacia la acción de sus herramientas inmunológicas. Aunque, con respecto al análisis estadístico, no se evidenciaron diferencias significativas entre los recuentos de estos dos grupos, pero es importante considerar que el promedio de los recuentos en camarones sin signos fue mayor a los promedios de los recuentos en camarones con otros clínicos.

Si se relaciona la presencia de signos clínicos con enfermedad estos resultados no lo evidencian; pero es registrado en la literatura que, actualmente, en organismos cultivados por los diferentes métodos de acuacultura se observan camarones con características externas de organismos sanos, durante y después de un periodo de estrés, pero después de un cierto tiempo puede desencadenarse la replicación de un patógeno, o en otras ocasiones los organismos son portadores asintomáticos del patógeno.

En el caso de la enfermedad viral analizada en este estudio (WSSV), se reporta que la presencia del virus no siempre determina la presencia de la enfermedad. La existencia de portadores subclínicos hace mucho más complicado su control (Loy Kou, 1998) y juega de nuevo un papel el concepto conocido como Hipótesis de la Tolerancia o Acomodación (más no resistencia). Por esto, la presencia del virus en el animal no siempre ocasiona su muerte en forma rápida e inevitable (infección aguda), sino que puede expresarse como una infección inocua que convierte al camarón en portador sano (infección crónica).

De probarse como válida la hipótesis, hará posible contar con poblaciones

embargo, es necesario enfatizar que es imprescindible estudiar al mismo tiempo el efecto de las variaciones ambientales y de manejo, debido a que la posible protección generada por la Acomodación estará limitada por el estrés al que es sometido el camarón (Melena, J. , 2000) y aquí es donde juega un papel importante la invasión de bacterias oportunistas en la hemolinfa de los camarones de cultivos, lo que resultaría en un estrés séptico, siendo esta co1infección detonante de brotes de enfermedad graves que podrían llevar a altos porcentajes de mortalidad.

Por otra parte el hecho de que los recuentos en camarones con otros signos clínicos diferentes a WSSV, fueran más bajos que los de camarones sin signos, se puede atribuir a que la evidencia de estos signos manifestaba la presencia de un factor que afecta al camarón y por ende el camarón ya había ejecutado sus sistemas de defensa.

En cuanto al coeficiente de variación, el valor obtenido en el caso de agar marino (76,6 %), aunque fue alto se considero bueno con base en coeficientes de variación obtenidos en otras investigaciones con otras especies (ej: bacterias aisladas de ríos) en los cuales los coeficientes de variación oscilan entre 60 % y 80 % (Vázquez, L. 1998 y Vega, F. 2008, com. pers.). En el caso de los resultados obtenidos en las siembras de TCBS para los recuentos de bacterias totales, sucrosa positiva y sucrosa negativa, los coeficientes de variación fueron muy elevados (mayores a 200 %). Estos porcentajes de coeficientes de variación tan elevados, pueden reflejar la variabilidad inherente de las concentraciones de bacterias en los ambientes acuáticos, las fluctuaciones de los factores ambientales (temperatura, salinidad, oxigeno, pH, nutrientes orgánicos e inorgánicos) que son bastante comunes en los sistemas de cultivo de camarones e influyen en las comunidades bacterianas presentes en los estanques y/o la cantidad de casos de recuentos con valores de 0 UFC/mL.

Este último factor de ausencia de crecimiento bacteriano, puede ser atribuido a que en la hemolinfa, la presencia de bacterias en organismos sanos es menor a las encontradas en hepatopáncreas, sin embargo es común aislar bacterias, incluso en

agar TCBS, donde se han encontrado valores de 103 UFC/mL, pero cabe resaltar que “sólo en algunos de los organismos muestreados”. Por lo tanto, la presencia de bacterias en órganos internos de camarones no es indicativo preciso de un proceso infeccioso. Para el diagnóstico es esencial determinar las cantidades y los tipos de bacterias presentes en agar TCBS principalmente, tanto en hemolinfa como en

hepatopáncreas (Gómez1Gil, 1998)

También esta gran cantidad casos de recuentos en 0 UFC/mL, obtenidos en el grupo de camarones que presentaron WSSV, puede atribuirse a que durante las infecciones algunos de los sistemas de defensa del camarón pueden alterarse. La infección WSSV, por ejemplo parece modular la expresión de varios genes en camarones,

incluyendo proteínas antimicrobianas (Leu 2007; Robalino 2007; Zhao

2007).

Además, la evaluación de salud de los crustáceos, a través del examen de hemolinfa, no suele ofrecer resultados claros y seguros, como ocurre con el examen de sangre en mamíferos. Esto dificulta de sobremanera, el establecimiento de índices de referencia o de un patrón de normalidad en crustáceos. Como consecuencia, la comparación de análisis de hemolinfa de crustáceos saludables e infectados y/o estresados, no presenta muchas veces significancia estadística (Barroco, M. et al. Morales, V. y J. Cuéllar1Anjel (eds), 2008).

Sin embargo, en la mayoría de los casos este estudio mostró, que la presencia de brotes de WSSV en los estanques de cultivo y la presencia de signos clínicos característicos de WSSV en los camarones muestreados, esta relacionada con el aumento de la carga microbiana en la hemolinfa de estos camarones. Este tipo de enfermedad, polimicrobial, fue comprobada en el estudio realizado por L. H. Phuoc en 2008, donde se reveló en condiciones de laboratorio que la infección a prior con WSSV refuerza la multiplicación y la capacidad de enfermedad inducida por

rápidamente y la densidad de la bacteria en la hemolinfa del camarón coinfectado fue

significativamente mayor que en el camarón solo inyectado con .

También en el estudio realizado por Selvin y Lipton en el 2003, se comprueba el mismo hecho, que el camarón debilitado por el WSSV sucumbió a la infección secundaria de "

Teniendo en cuenta las anteriores investigaciones, se puede decir que los recuentos bacterianos elevados obtenidos en el presente estudio, a partir de la siembra de hemolinfa de camarones relacionados con “brotes” o específicamente con los signos clínicos de WSSV, se dan por el efecto de la sinergia del virus de síndrome de mancha blanca (WSSV) y de las bacterias oportunistas presentes en la hemolinfa de los camarones, sobre el desarrollo de enfermedad en estos organismos.

Según las afirmaciones del estudio realizado por Phuoc 2008 la presencia de V.

campbellii no proporciona aumento de la repetición de WSSV, pero la presencia del virus si causa un aumento considerado en la densidad de V. campbellii en la hemolinfa, produciendo una mortalidad más rápida.

Por la amplia distribución de estos dos microorganismos que afectan al camarón (WSSV y bacterias potencialmente patógenas) en los estanques de cultivo; la co1 infección de WSSV y Vibrio puede ocurrir regularmente en el campo.

Sin embargo, se requiere de una investigación detallada que explique la importancia y el mecanismo exacto de las infecciones polimicrobiales en los estanques de cultivo del camarón.