25 CAPITULO VI
RESULTADOS
Controles y polimorfismo de un solo nucleótido del gen MMP1.
En orden de frecuencia los genotipos 1G/1G, 1G/2G y 2G/2G (12.6%, 41.4% y 46%) estuvieron presentes en el grupo control del estudio. La distribución de los genotipos se puede apreciar en la TABLA 1.
El alelo con mayor frecuencia fue el 2G (64.2%), similar a la reportado en la base de datos de NCBI SNP en otro grupo control de población hispana (63%). (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term=rs1799750).
Pacientes con EADr y polimorfismo de un solo nucleótido del gen MMP1. El polimorfismo 2G del gen MMP1 fue consistente con el equilibrio de Hardy-Weinberg tanto en pacientes como en controles. El alelo con mayor presencia en nuestro grupo de pacientes fue el 2G (58.4%) mostrando menos frecuencia comparada con los controles, sin embargo esta diferencia no es estadísticamente significativa (p>0.05). Las frecuencias alélicas para 2G fueron respectivamente para EADr-G y EADr-Sg, 60.7% y 56.2%. TABLA 1.
Asociación clínica de los grupos EADr-G y EADr-Sg con el polimorfismo 2G del gen MMP1
Al compararse las frecuencias de los genotipos no se encontró diferencia significativa entre el grupo de pacientes EADr-Sg (OR = 0.38, CI95% 0.12 –
26 1.21), EADr-G (OR = 1.03, CI95% 0.21 – 4.96) y el grupo control como se muestra en la TABLA 2.
27 CAPITULO VII
DISCUSIÓN
La regulación del gen MMP1 depende directamente de la producción endógena de los inhibidores tisulares de las metaloproteinasas (ITMPs). Este sistema homeostático ocurre en el proceso normal de la cicatrización de una herida, y como en los pacientes con EADr la piel se encuentra en constante reparación puede llevar a problemas en el balance de la MMP-1 y sus inhibidores.
El polimorfismo 2G del gen MMP1 tiene una actividad elevada de trascripción en la expresión de MMP-1 aumentando su función de colagenasa y por lo tanto ha sido asociado a una mayor invasión por cáncer, artritis y otras enfermedades donde el colágeno está involucrado.
Se ha propuesto que esta variable genética que aumenta la expresión de MMP-1, puede tener un papel modulador en la severidad de la enfermedad en paciente con EADr y poder definir valores pronósticos de importancia así como el diseño de terapias celulares que puedan usarse en pacientes con EADr46. Kern y colaboradores, sugirieron que dado el número pequeño de pacientes con EADr disponibles en el mundo, es esencial el estudio de este polimorfismo en la severidad clínica de los pacientes de diferentes grupos poblacionales47.
Al igual que Salas y colaboradores48, nosotros encontramos que la mutación 2470insG del gen COL7A1 localizado en el exón 18/19 es el de más prevalencia en nuestro grupo de pacientes. Es de esperarse que el fenotipo en estos pacientes tengan un genotipo homogéneo, pero como se puede observar
28 en la TABLA 3 no todos los pacientes con la mutación ´x 18/19, 2470insG del gen COL7A1 tienen las mismas características físicas. Sin embargo, no se encontró relación entre el polimorfismo 2G del gen MMP1 con el genotipo de los pacientes, con esto podemos asumir que existen otros factores modificadores de la enfermedad involucrados.
En nuestro estudio analizamos 130 individuos controles cuyos cuatro abuelos provinieran específicamente del Noreste de México y fueron comparados con 30 pacientes del mismo antecedente geográfico.
La frecuencia alélica del polimorfismo 2G en la población hispánica es diferente a la encontrada en la población caucásica donde el alelo más frecuente es el 1G (56.7%) al contrario de la población hispánica donde el alelo 2G es el más frecuente (63%).
Esta mayor frecuencia alélica del polimorfismo 2G podría sugerir una mayor severidad clínica en pacientes con EADr, sin embargo independientemente del tipo de mutación del gen COL7A1, los pacientes con menor severidad mostraron mayor frecuencia del polimorfismo comparado con los pacientes EADrSg.
No encontramos diferencias significativas entre el grupo control y los pacientes con EADrSg. Consideramos que es importante aumentar el tamaño de muestra y estudiar el polimorfismo en otros grupos poblacionales para determinar, en caso de que exista, la contribución del polimorfismo en la porción promotora del gen MMP1 en la EADr.
29 CAPITULO VIII
CONCLUSIÓN
No encontramos diferencia significativa entre la severidad clínica de pacientes con EADr y el polimorfismo 2G de la porción promotora del gen
MMP1 en nuestra cohorte del Noreste de México. Dada la baja incidencia de
esta enfermedad, se necesitan realizar estudios en otros grupos poblacionales para valorar el impacto real del polimorfismo 2G en la severidad clínica de los pacientes. La principal limitación de nuestro estudio fue que los controles no fueron pareados con cada uno de los casos de los grupos de pacientes, sin embargo la proporción de controles-pacientes fue de 3:1 para poder dar un suficiente peso estadístico al estudio.
Realizar futuros análisis del balance entre las proteasas y sus inhibidores, podrían esclarecer el rol de las MMPs y la EA, y ayudar a encontrar nuevas alternativas terapéuticas que puedan aumentar la calidad de vida en los pacientes con EADr.
30 CAPITULO IX
ANEXOS
TABLA 1. Frecuencia alélica del polimorfismo de un solo nucleótido del gen MMP1.
Genotipo Controles EADr-G EADr-Sg HISPANICa
1G/1G 19 (12.6%) 2 (14.3%) 5 (31.2%) 17.4% 1G/2G 55 (41.4%) 7 (50.0%) 4 (25.0%) 39.1% 2G/2G 56 (46.0%) 5 (35.7%) 7 (43.8%) 43.5% N° total de pacientes 130 14 16 23 1G frecuencia alélica 0.3577 0.3929 0.4375 0.370 2G frecuencia alélica 0.6423 0.6071 0.5625 0.630
EADr-G, epidermólisis ampollosa distrófica recesiva otras Generalizadas, EADr-Sg, epidermólisis ampollosa severa generalizada. aVeintitrés individuos de descendencia hispana.
31
TABLA 2. Asociación del polimorfismo de un solo nucleótido del gen MMP1 con la
clínica de los grupos de pacientes con EADr-G y EADr-Sg-.
X2 OR CI95% Valor P
Controles vs EADr-G 0.00 1.03 [0.21 – 4.96] 0.97 Controles vs EADr-Sg 2.87 0.38 [0.12 – 1.21] 0.09
32
TABLA 3. Fenotipos de las EADr, Mutaciones de COL7A1 y Polimorfismo del gen
MMP1
Código Edad MUT1 MUT2 Fenotipo
Esperado Fenotipo Actual Puntuació n BEBS MMP1 SNP
GEP1062 38 ´x 56, G1703E ´x 69, 5772insT O O 15.6 2G/2G GEP1061 52 ´x 18/19, 2471insG ´x 56, G1703E O SG 23.5 2G/2G GEP1095 35 ´x 56, G1703E ´x 69, 5772insT O O 24.1 2G/2G GEP1057 32 ´x 18/19, 2471insG ´x 18/19, 2471insG SG SG 23.4 2G/2G GEP1074 37 ´x 56, G1703E ivs23-1G>A O SG 20.5 2G/2G GEP1060 42 ´x 56, G1703E ivs23-1G>A O SG 20.75 2G/2G GEP1072 19 ´x 73, 6026 G>C;
G2009A N/A O SG 20.75 2G/G
GEP1133 42 ´x 18/19, 2471insG ´x 18/19, 2471insG SG O 26.75 2G/G GEP1076 32 ´x 18/19, 2471insG ´x 18/19, 2471insG
SG O 27 2G/G
G0847+ 62 ´x 18/19, 2471insG ´x 18/19, 2471insG SG O 29.5 2G/G GEP1055 29 ´x 56, G1703E ´x 84, c.6696insC O O 15.5 2G/G GEP1068 36 ´x 18/19, 2471insG ´x 18/19, 2471insG SG O 8.75 G/G GEP1066 35 ´x 18/19, 2471insG ´x 18/19, 2471insG SG O 15.5 G/G GEP577 27 ´x 18/19, 2471insG ´x 32, 3948insT SG SG 19.5 G/G GEP1067 37 ´x 18/19, 2471insG ´x 18/19, 2471insG SG SG 20 G/G GEP1065 16 'x79 6501G>A N/A O SG 30 G/G
GEP1073 16 N/A N/A N/A SG 59.75 G/G
GEP1048 5 NA NA N/A O 12 2G/2G
GEP1064 11 N/A N/A N/A SG 19.6 2G/2G
GEP1069 9 N/A N/A N/A O 20.75 2G/2G
GEP1075 16 N/A N/A N/A SG 29 2G/2G
GEP1093 16 N/A N/A N/A SG 31 2G/2G
GEP1053 25 N/A N/A N/A O 15.5 2G/2G
GEP1058 6 N/A N/A N/A O 6.7 2G/G
GEP1056+ 10 NA NA N/A SG 15 2G/G
GEP1059 16 N/A N/A N/A SG 23.4 2G/G
GEP946 39 N/A N/A N/A SG 34.5 2G/G
GEP1047 5 N/A N/A N/A O 15.5 2G/G
GEP1049+ 19 N/A N/A N/A O 6.7 2G/G
GEP1071 6 N/A N/A N/A SG 18.5 G/G
EADr-G, epidermólisis ampollosa distrófica recesiva otras Generalizadas, EADr-Sg,
epidermólisis ampollosa severa generalizada, BEBS, The Birmingham Epidermolysis Bullosa Severity score; + , Finados durante el estudio..
33 CAPITULO X
BIBLIOGRAFIA
1. H. K. Hereditare anlage zur blasenbildung (epidermolysis hereditaria). Volume 12: Dtsch Med Wochenschr, 1886:21-2.
2. PEARSON R. Studies on the pathogenesis of epidermolysis bullosa. J Invest Dermatol. 1962 Dec; 39:551-75.
3. Aumailley M, Has C, Tunggal L, Bruckner-Tuderman L. Molecular basis of inherited skin-blistering disorders, and therapeutic implications. Expert Rev Mol Med. 2006;8(24):1-21.
4. Smith F, Eady R, Leigh I, et al. Plectin deficiency results in muscular dystrophy with epidermolysis bullosa. Nat Genet. 1996 Aug;13(4):450-7. 5. Varki R, Sadowski S, Pfendner E, Uitto J. Epidermolysis bullosa. I.
Molecular genetics of the junctional and hemidesmosomal variants. J Med Genet. 2006 Aug;43(8):641-52.
6. Varki R, Sadowski S, Uitto J, Pfendner E. Epidermolysis bullosa. II. Type VII collagen mutations and phenotype-genotype correlations in the dystrophic subtypes. J Med Genet. 2007 Mar;44(3):181-92.
7. Fine J, Bauer E, Briggaman R, et al. Revised clinical and laboratory criteria for subtypes of inherited epidermolysis bullosa. A consensus report by the Subcommittee on Diagnosis and Classification of the National Epidermolysis Bullosa Registry. J Am Acad Dermatol. 1991 Jan;24(1):119-35.
8. Fine J, Eady R, Bauer E, et al. Revised classification system for inherited epidermolysis bullosa: Report of the Second International Consensus Meeting on diagnosis and classification of epidermolysis bullosa. J Am Acad Dermatol. 2000 Jun;42(6):1051-66.
9. Fine J, Eady R, Bauer E, et al. The classification of inherited epidermolysis bullosa (EB): Report of the Third International Consensus Meeting on Diagnosis and Classification of EB. J Am Acad Dermatol. 2008 Jun;58(6):931-50.
10. Fine J-D, National Epidermolysis Bullosa Registry (U.S.). Epidermolysis bullosa : clinical, epidemiologic, and laboratory advances, and the findings of the National Epidermolysis Bullosa Registry. Baltimore: Johns Hopkins University Press; 1999. xviii, 490 p. p.
11. Stephens K, Ehrlich P, Weaver M, Le R, Spencer A, Sybert V. Primers for exon-specific amplification of the KRT5 gene: identification of novel and recurrent mutations in epidermolysis bullosa simplex patients. J Invest Dermatol. 1997 Mar;108(3):349-53.
12. Schuilenga-Hut P, Vlies P, Jonkman M, Waanders E, Buys C, Scheffer H. Mutation analysis of the entire keratin 5 and 14 genes in patients with epidermolysis bullosa simplex and identification of novel mutations. Hum Mutat. 2003 Apr;21(4):447.
34 13. Horn H, Priestley G, Eady R, Tidman M. The prevalence of epidermolysis
bullosa in Scotland. Br J Dermatol. 1997 Apr;136(4):560-4.
14. Ryan M, Tizard R, VanDevanter D, Carter W. Cloning of the LamA3 gene encoding the alpha 3 chain of the adhesive ligand epiligrin. Expression in wound repair. J Biol Chem. 1994 Sep;269(36):22779-87.
15. Pulkkinen L, Jonkman M, McGrath J, Kuijpers A, Paller A, Uitto J. LAMB3 mutations in generalized atrophic benign epidermolysis bullosa: consequences at the mRNA and protein levels. Lab Invest. 1998 Jul;78(7):859-67.
16. Pulkkinen L, Gerecke D, Christiano A, Wagman D, Burgeson R, Uitto J. Cloning of the beta 3 chain gene (LAMB3) of human laminin 5, a candidate gene in junctional epidermolysis bullosa. Genomics. 1995 Jan;25(1):192-8.
17. Fine JD, Johnson LB, Weiner M, Li KP, Suchindran C. Epidermolysis bullosa and the risk of life-threatening cancers: The National EB Registry experience, 1986-2006. J Am Acad Dermatol. 2008 Nov 19.
18. Hovnanian A, Rochat A, Bodemer C, et al. Characterization of 18 new mutations in COL7A1 in recessive dystrophic epidermolysis bullosa provides evidence for distinct molecular mechanisms underlying defective anchoring fibril formation. Am J Hum Genet. 1997 Sep;61(3):599-610. 19. Sakai L, Keene D, Morris N, Burgeson R. Type VII collagen is a major
structural component of anchoring fibrils. J Cell Biol. 1986 Oct;103(4):1577-86.
20. Uitto J, Richard G. Progress in epidermolysis bullosa: from eponyms to molecular genetic classification. Clin Dermatol.23(1):33-40.
21. Christiano A, Hoffman G, Chung-Honet L, et al. Structural organization of the human type VII collagen gene (COL7A1), composed of more exons than any previously characterized gene. Genomics. 1994 May;21(1):169- 79.
22. Christiano A, Greenspan D, Lee S, Uitto J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J Biol Chem. 1994 Aug;269(32):20256-62.
23. Christiano A, Rosenbaum L, Chung-Honet L, et al. The large non- collagenous domain (NC-1) of type VII collagen is amino-terminal and chimeric. Homology to cartilage matrix protein, the type III domains of fibronectin and the A domains of von Willebrand factor. Hum Mol Genet. 1992 Oct;1(7):475-81.
24. Ryynänen J, Sollberg S, Olsen D, Uitto J. Transforming growth factor- beta up-regulates type VII collagen gene expression in normal and transformed epidermal keratinocytes in culture. Biochem Biophys Res Commun. 1991 Oct;180(2):673-80.
25. Brittingham R, Uitto J, Fertala A. High-affinity binding of the NC1 domain of collagen VII to laminin 5 and collagen IV. Biochem Biophys Res Commun. 2006 May;343(3):692-9.
35 26. Shimizu H, Ishiko A, Masunaga T, et al. Most anchoring fibrils in human skin originate and terminate in the lamina densa. Lab Invest. 1997 Jun;76(6):753-63.
27. Chen M, Marinkovich M, Veis A, et al. Interactions of the amino-terminal noncollagenous (NC1) domain of type VII collagen with extracellular matrix components. A potential role in epidermal-dermal adherence in human skin. J Biol Chem. 1997 Jun;272(23):14516-22.
28. Järvikallio A, Pulkkinen L, Uitto J. Molecular basis of dystrophic epidermolysis bullosa: mutations in the type VII collagen gene (COL7A1). Hum Mutat. 1997;10(5):338-47.
29. Moss C. The Birmingham Epidermolysis Bullosa Severity score: development and validation. In: Wong A (ed). Volume 160. British Journal of Dermatology, 2009:1057 - 65.
30. Gardella R, Zoppi N, Zambruno G, Barlati S, Colombi M. Different phenotypes in recessive dystrophic epidermolysis bullosa patients sharing the same mutation in compound heterozygosity with two novel mutations in the type VII collagen gene. Br J Dermatol. 2002 Sep;147(3):450-7.
31. Wessagowit V, Kim S, Woong Oh S, McGrath J. Genotype-phenotype correlation in recessive dystrophic epidermolysis bullosa: when missense doesn't make sense. J Invest Dermatol. 2005 Apr;124(4):863-6.
32. Kern J, Kohlhase J, Bruckner-Tuderman L, Has C. Expanding the COL7A1 mutation database: novel and recurrent mutations and unusual genotype-phenotype constellations in 41 patients with dystrophic epidermolysis bullosa. J Invest Dermatol. 2006 May;126(5):1006-12. 33. Shimizu H, McGrath J, Christiano A, Nishikawa T, Uitto J. Molecular basis
of recessive dystrophic epidermolysis bullosa: genotype/phenotype correlation in a case of moderate clinical severity. J Invest Dermatol. 1996 Jan;106(1):119-24.
34. Yonei N, Ohtani T, Furukawa F. Recessive dystrophic epidermolysis bullosa: case of non-Hallopeau-Siemens variant with premature termination codons in both alleles. J Dermatol. 2006 Nov;33(11):802-5. 35. Bauer E, Eisen A. Recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Evidence
for increased collagenase as a genetic characteristic in cell culture. J Exp Med. 1978 Nov;148(5):1378-87.
36. Stricklin G, Welgus H, Bauer E. Human skin collagenase in recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Purification of a mutant enzyme from fibroblast cultures. J Clin Invest. 1982 Jun;69(6):1373-83.
37. Chakraborti S, Mandal M, Das S, Mandal A, Chakraborti T. Regulation of matrix metalloproteinases: an overview. Mol Cell Biochem. 2003 Nov;253(1-2):269-85.
38. Ala-aho R, Kähäri V. Collagenases in cancer. Biochimie.87(3-4):273-86. 39. Seltzer J, Eisen A, Bauer E, Morris N, Glanville R, Burgeson R. Cleavage
of type VII collagen by interstitial collagenase and type IV collagenase (gelatinase) derived from human skin. J Biol Chem. 1989 Mar;264(7):3822-6.
36 40. Sato T, Nomura K, Hashimoto I. Expression of collagenase and stromelysin in skin fibroblasts from recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Arch Dermatol Res. 1995;287(5):428-33.
41. Bodemer C, Tchen S, Ghomrasseni S, et al. Skin expression of metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases in sibling patients with recessive dystrophic epidermolysis and intrafamilial phenotypic variation. J Invest Dermatol. 2003 Aug;121(2):273-9.
42. Rutter J, Mitchell T, Butticè G, et al. A single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase-1 promoter creates an Ets binding site and augments transcription. Cancer Res. 1998 Dec;58(23):5321-5.
43. Kanamori Y, Matsushima M, Minaguchi T, et al. Correlation between expression of the matrix metalloproteinase-1 gene in ovarian cancers and an insertion/deletion polymorphism in its promoter region. Cancer Res. 1999 Sep;59(17):4225-7.
44. Ghilardi G, Biondi M, Mangoni J, et al. Matrix metalloproteinase-1 promoter polymorphism 1G/2G is correlated with colorectal cancer invasiveness. Clin Cancer Res. 2001 Aug;7(8):2344-6.
45. Ye S, Dhillon S, Turner S, et al. Invasiveness of cutaneous malignant melanoma is influenced by matrix metalloproteinase 1 gene polymorphism. Cancer Res. 2001 Feb;61(4):1296-8.
46. Titeux M, Pendaries V, Tonasso L, Décha A, Bodemer C, Hovnanian A. A frequent functional SNP in the MMP1 promoter is associated with higher disease severity in recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Hum Mutat. 2008 Feb;29(2):267-76.
47. Kern J, Grüninger G, Imsak R, et al. Forty-two novel COL7A1 mutations and the role of a frequent single nucleotide polymorphism in the MMP1 promoter in modulation of disease severity in a large European dystrophic epidermolysis bullosa cohort. Br J Dermatol. 2009 Nov;161(5):1089-97. 48. César Salas-Alanis J, McGrath J. [2470insG, represents the commonest
mutation in Mexican patients with dystrophic bullous epidermolysis. A study of 21 families]. Gac Med Mex.142(1):29-34.
49. Salas-Alanis J, Amaya-Guerra M, McGrath J. The molecular basis of dystrophic epidermolysis bullosa in Mexico. Int J Dermatol. 2000 Jun;39(6):436-42.
50. Garza-Gómez J. Level of type vii collagenat the basement membrane does not always correlate with clinical severity in acohort of 13 mexican patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Annual Meeting of the Society of Investigative Dermatology. Montreal, Canada: Journal of Investigative Dermatology;129: S1-S145
51. Coggon D, Rose G. Epidemiology for the uninitiated. 4th ed. London, UK: British Medical Journal Publishing Group; 1997.
37 CAPITULO XI