La red EU Kids Online

We  prospectively  followed  three  HLA‐A2.1  positive  patients  with  histologically  documented  melanoma  who  received  DC‐based  immunotherapy  and  subsequently  developed vitiligo (table 1).  

Patient 1. Patient 1 was diagnosed, two years prior to inclusion, with melanoma 

of  the  scalp  with  regional  lymph  node  metastases  (T3aN2aM0),  for  which  a  radical  lymph  node  dissection  was  performed.  She  relapsed  with  regional  lymph  node  and  cutaneous metastases, which were resected and treated with adjuvant radiotherapy.  At inclusion, this patient presented with multiple subcutaneous and lung metastases.  The  patient  was  vaccinated  intranodally  with  antigen  loaded  mature  DCs16  but  treatment was discontinued after 3 vaccinations because of progression of cutaneous  metastases. She developed vitiligo in the flank during further tumor progression. 

Patient  2.  Patient  2  was  diagnosed,  twelve  years  prior  to  inclusion,  with 

melanoma  located  on  the  right  lower  leg  (T1aN0M0),  which  was  surgically  removed.  From 1997 on, the patient relapsed with in transit and distant cutaneous metastases,  for which he was treated with regional limb perfusion (melfalan) and dacarbazine. At  inclusion, he was diagnosed with lymph node metastases and multiple (sub‐)cutaneous  metastases  for  which  he  was  repeatedly  vaccinated  intranodally  with  antigen  loaded  mature DCs. After 3 vaccinations, the patient developed vitiligo in the neck region and  dorsal  side  of  both  hands.  To  date,  the  vitiligo  still  progresses  and  affects  the  head,  back, hands and legs.  

Patient  3.  Patient  3  was  diagnosed,  6  months  prior  to  inclusion,  with  a 

superficial  spreading  melanoma  of  the  left  thigh  (T1a/bN0M0).  At  inclusion  she  presented  with  an  inguinal  lymph  node  metastasis,  for  which  a  radical  lymph  node  dissection  was  performed.  She  was  vaccinated  intradermally  in  an  adjuvant  setting  with antigen loaded mature DCs. After 8 vaccinations, she developed a severe rash in  the  neck  region,  thorax,  back  and  upper  extremities  and  subsequent  vitiligo  in  these  areas.  

  Vitiligo development in melanoma patients upon vaccination with DCs has been  reported before.18,19 Although not investigated, it is currently believed that the vitiligo  in  these  patients  results  from  sensitization  to  antigens  shared  by  melanocytes  and  melanoma cells. To address this question we took perilesional biopsies and studied the  vitiligo infiltrating immune cells. 

Vaccine specific lymphocytes infiltrate vitiligo lesions  

Immunohistochemical  analysis  of  the  vitiligo  in  all  three  patients  demonstrates  perilesional  infiltration  of  T  cells  (figure  1a,b).  With  tetramer  analysis,  CD8+  T  cells  specific for one or more gp100 and tyrosinase HLA‐A2.1 epitopes were detected at low  frequencies  in  the  peripheral  blood  after  vaccination  in  all  three  patients.  Gp100  or  tyrosinase  specific  CD8+ T  cells  were  not  detectable  prior  to  vaccination  (data  not  shown).  Interestingly,  specific  CTLs  were  detected  at  increased  concentrations  in  the  vitiligo  lesion  compared  to  peripheral  blood  (table  1).  This  phenomenon  was  most  obvious in patient 3 (figure 1c,d). The accumulation of these CTLs in the vitiligo lesions  

Table 1. Patient characteristics and tetramer specific CTLs after immunotherapy  a)  number of vaccinations prior to occurrence of vitiligo   b) _{Percentage of tetramer specific CD8+ T cells compared to total CD8+ T cells}  c)  no specific CTLs for gp100, tyrosinase and Melan‐A were detected in the blood prior to immunotherapy  d)  flowcytometry results for gp100 specific CTLs infiltrating the melanoma are shown in figure 3a,b  LN = lymphnode, TTP = time to progression (months), AWD = Alive with disease, NDD = no detectable disease, DTH  = delayed type hypersensitivity‐assay, n.a. = not available   

can  result  from  specific  migration20  and/or  a  local  proliferation  advantage  for  MDA  specific CTLs induced by perilesional antigen exposure.  

Although the immunotherapy was not primarily directed against the Melan‐A epitope,  Melan‐A specific CTLs were observed in the vitiligo lesions and tumor lesion of patient  1 and 2 (table 1 and figure 3). This finding is consistent with the observation that anti‐ tumor vaccines can have effects beyond their intrinsic specificity. It is shown that the  interaction  of  vaccine  specific  T  cells  with  melanoma  cells  may  trigger  a  broad  activation of other anti‐tumor T cells, a phenomenon called epitope spreading.21,22   

Localisation   Prior treatment  Vacci‐ nations a)   TTP  Current  status  (months)    gp100154   epitope  gp100280   epitope  Tyro‐ sinase  Melan‐A   

DTH  n.a.  n.a.  n.a.  n.a. 

Blood c)   0.01  0.03  0.00  0.03  Vitiligo  0.05  0.02  0.00  1.4  1. / F / 20  M1b (IV)  Lung, skin,  LN  Post‐surgery RTx  3  7  AWD (21)  Melanoma   0.32 d)   0.04  0.02  1.7 d)   DTH  0.06  0.04  0.15  n.a.  Blood c)   0.10  0.82  0.01  0.01 

2. / M / 71  M1a (IV)  Distant skin  Dacarbazine,   Melfalan,     DNCB cream  3  38  AWD (56)  Vitiligo  0.00  1.6  0.77  1.13  DTH   0.01  0.04  0.01  n.a.  Blood c)   0.27  0.21  0.07  0.06  3. /F / 53  N1b (III)  LN  none  7  NDD  NDD (21)  Vitiligo   4.40  24.2  0.16  0.05  Figure 1  A            B  C  D  Vaccine‐specific CTLs accumulate  at  the  vitiligo  lesion.  Perilesional 

6‐mm  skin  biopsies  were  taken  from  each  patient  (A).  CD‐3  staining  of  the  periolesional  skin  showing  lymphocyte  infiltrates  (B),  original  magnification  200x.  Flowcytometry  of  peripheral  blood  lymphocytes  (PBLs,  C)  and  vitiligo  infiltrating  lymphocytes  (VILs, D) from one representative  patient  (patient  3).  From  the  scatterplot the lymphocytes were  gated  and  double  stained  with  anti‐CD8‐FITC  and  tetramer‐PE.  The  numbers  in  the  dot  plots  indicate  the  percentage  of 

Vitiligo infiltrating lymphocytes produce IFN‐γ after specific stimulation 

To test whether vitiligo infiltrating lymphocytes (VILs) were functional, we stimulated  these cells with gp100 or tyrosinase expressing target cells and measured subsequent  IFN‐γ  and  IL‐2  production.  VILs  of  patients  1  and  3  produce  IFN‐γ  and  IL‐2  when  exposed  to  gp100‐target  cells  and  VILs  of  patient  2  produce  IFN‐γ  and  IL‐2  when  exposed to both gp100 and tyrosinase‐target cells. No cytokines were produced when  VILs were exposed to unloaded control target cells (figure 2).  

From  patients  1  and  2  we  were  able  to  culture  melanoma  cell  lines  from  metastases.  Interestingly,  the  VILs  also  produced  IFN‐γ  and  IL‐2  when  stimulated  by  the  autologous  tumor  cell  line  (figure  2).  The  cross  reactivity  of  the  VILs  with  autologous tumor cells further supports the hypothesis that the vitiligo is a marker of  immunity against melanoma cells.    Vitiligo lesions in our patients did not specifically occur at the vaccine injection‐ site, at the site of the primary tumor, or in close proximity of new metastases. From  this we conclude that the melanoma‐associated vitiligo is not caused by a direct and  local side‐effect of tumor destruction, but rather by the presence of circulating MDA‐ specific  CTLs.  Although  we  did  not  use  MHC  class  II  peptides  in  our  vaccination  protocol,  our  data  do  not  exclude  that  specific  CD4+  cells  are  involved.  MDA‐specific  epitopes  recognized  by  CD4+  T  cells  have  been  reported23  and  it  is  also  known  that  melanocytes  can  present  peptides  in  an  MHC  class  II  restricted  manner.24  These  observations suggest that melanocyte destruction may not only depend on MHC class  I‐restricted cells.      Figure 2  A  B  C 

Vitiligo  infiltrating  lymphocytes  produce IFN‐γ and IL‐2 upon specific  stimulation. IFN‐γ (black bars) and IL‐

2  (white  bars)  production  of  VILs  after  stimulation  with  non‐specific  and  specific  stimuli  of  patient  1  (A)  patient  2  (B)  and  patient  3  (C).  T2  cells  are  loaded  with  respectively  irrelevant peptide, tyrosinase peptide  and  gp100  peptides.  BLM  cells  are  transfected  with  respectively  control  protein G250, tyrosinase protein and  gp100  protein  (see  also  material  en  methods).  From  patients  1  and  2  melanoma  cell  lines  were  cultured,  the VILs produced high levels of  IFN‐ γ  and  IL‐2  when  stimulated  by  the  autologous  tumor  cells.  N.a.  not  available. 

Immunotherapy‐associated vitiligo and prognosis 

Our case series is too limited to afford decisive conclusions on the prognostic value of  vitiligo  on  melanoma  disease.  The  presence  of  durable  non‐progressive  disease  in  patients  2  and  3  suggest  that  the  immunotherapy  induced  vitiligo  lesions  are  a  favourable prognostic factor. We further show that all three patients have a relatively  high number of  MDA‐specific T cells in the blood, DTH biopsies and melanoma. Earlier  papers have described a correlation with the presence of MDA‐specific T cells in these  compartments and favourable outcome.16,25   

Despite  the  presence  of  functional  melanoma  specific  T  cells,  patient  1  had  progressive disease. This is intriguing since the tumor expressed the MDAs gp100 and  Melan‐A (IHC figure 3a,b) and was infiltrated by CTLs that specifically recognize these  epitopes  (inserts  figure  3a,b  and  table  1).  Several  mechanisms  may  account  for  the  escape  of  melanoma  cells  to  immune  surveillance.26  It  has  recently  been  published  that  CD4+FoxP3+CD25+  regulatory  T  cells  (Tregs)  can  infiltrate  melanoma  tumors  and  locally  suppress  cytotoxic  anti‐tumor  responses,  also  in  vaccinated  melanoma  patients.27  Infiltration  of  melanoma  tumors  with  Tregs  correlates  with  poor  prognosis.28  In  the  melanoma  metastasis  of  patient  1,  we  detected  that  27%  of  the  tumor  infiltrating  CD4+  T  cells  consisted  of  CD4+FoxP3+CD25+CD127‐  Tregs  vs  4%  of  Tregs in the blood of this patient (data not shown).  

Altogether,  our  data  support  an  association  between  vitiligo  and  favourable  outcome.  However,  active  vaccine‐induced  vitiligo  does  not  exclude  tumor  progression.  The  dichotomy  between  MDA‐specific  CTL  responses  in  melanoma  and  vitiligo might result from quantitative CTL differences, the quality of the CTLs such as T  cell receptor affinity and cytokine production,29 the amount of antigen presented30,31  and the different environmental conditions in which these T cells exert their function.26     Figure 3  A      B

Accumulation  of  MDA‐specific  CTLs  in  the  melanoma  metastasis  of  patient  1. 

Immunohistochemistry  of  paraffin  sections  from  the  melanoma  tumor  of  patient  1,  showing  melanoma  cells  that  stain  positive  for the proteins gp100 (A) and Melan‐A (B).  Original  magnification  200x.  Small  inserts  show  tetramer‐analysis.  CD8+  _{T  cells} 

(horizontal  axis)  are  plotted  against  gp100154‐162‐epitope  and  Melan‐A26‐35‐ epitope  tetramers  (vertical  axis)  showing  0.32%  gp100  (A)  and  1.7%  Melan‐A  (B)  specific CTLs (see also table 1).