Reformulación de la hipótesis sobre la estructura de la BSA NP

En esta sección se realizaron diferentes ensayos que permitieron ajustar las condiciones propuestas en la hipótesis sobre la formación de la BSA NP formulada al comienzo de este trabajo. Los resultados permiten discernir la construcción y organización espacial de las moléculas de albúmina durante el proceso de obtención de la NP. Como resultado se sugiere que la BSA NP es una nanoestructura con un diámetro hidrodinámico de 70 nm, de forma esferoide (Esquema 24). Las albúminas están agregadas heterogéneamente, en regiones con mayor y menor concentración. Las posibles uniones intermoleculares son:

 Estructuras símil lámina β: cuya finalidad es la de suplir los puentes de hidrógeno perdidos durante el proceso de desolvatación

 Reorganización y formación de nuevos puentes disulfuros

Estas uniones se estabilizan durante el proceso de irradiación γ, proceso en el cual se entrega suficiente energía para romper enlaces y fortalecer y generar otros. No obstante, no todas las interacciones intermoleculares tienen igual fuerza. Las albúminas más superficiales están unidas más débilmente. Esto hace que frente a condiciones levemente adversas, como es un SDS-PAGE, la NP pierde su “capa exterior”. Así, se sugiere la diferenciación de dos capas de la BSA NP: una superficial y otra denominada

core. Es en esta última donde las interacciones entre BSAs están más reforzadas

logrando que no se desprendan fácilmente (Esquema 24).

Las moléculas de albúmina en la NP tienen una disposición espacial organizada. Mediante microscopía se observó la forma esferoide de la NP, por lo que se propone una esfera rígida. La posibilidad que se discute para las BSA NPs es parte de la teoría de la organización de un sólido cristalino en una red en donde sus puntos (moléculas proteicas en este caso) están organizados de una determinada manera. Por estructura de la proteína y siguiendo esta línea de pensamiento, se sugiere que la BSA NP cuenta con una fracción de empaquetamiento, en donde hay espacios “huecos” no ocupados por proteínas (Esquema 24).

Durante el trabajo realizado se encontraron indicios de estos espacios, observados como por ejemplo en la microscopia A.F.M como las zonas claras y oscuras de la superficie. Al estudiar la interacción de la NP con las dos drogas elegidas, especialmente E, se observó que la BSA NP contaba con mayor capacidad de carga de la BSA. Ambos vehículos parten de una concentración igual de proteína inicial. Sin embargo, la NP cuenta con uno de los bolsillos de unión bloqueado a la interacción con

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MC540 en principio (Sitio Sudlow II). Recordando que el E es una droga con gran carácter hidrofóbico, es lógico su elección por bolsillos con un ambiente hidrofóbico para unirse. Debido a este razonamiento y los resultados obtenidos, se sugirió la formación de nuevos bolsillos hidrofóbicos durante la irradiación. Estos bolsillos pueden, a su vez, ser interpretados como lugares vacíos entre las moléculas de albúmina formando la NP. Esta explicación se ajusta al modelo de red cristalina compuesto por celdas primitivas centradas en las caras. Dicha celda como se observa en el Esquema 18 presenta espacios vacíos entre las albúminas.

Por ende, en vez de tener una BSA NP maciza y compacta de 148 MDa de peso molecular como se pensaba, se tiene una BSA NP maciza, pero con regiones de mayor concentración de agregado proteico de 115 MDa aproximadamente. La NP está compuesta por una mayor cantidad de moléculas (3950 aproximadamente, contrario a las 2250 calculadas teóricamente) (Esquema 24).

Esquema 25 Radiografía de la BSA NP según los datos experimentales obtenidos durante la

caracterización biofísica. (a) Aspectos más globales: densidad, diámetro hidrodinámico, albúminas totales por NP y proteínas superficiales. (b) Posible organización espacial de las proteínas en la BSA NP en zonas de mayor o menor concentración contribuyendo a una superficie heterogénea. (c) División de capas de la BSA NP según las fuerzas entre las moléculas de albúmina. (d) Posible disposición de los bolsillos de unión a droga (Sitio Sudlow I y nuevos sitios generados por el proceso de obtención), grupos funcionales expuestos en la superficie de la NP y distintos enlaces inter e intra moleculares necesarios para la formación de la BSA NP (enlaces generando estructuras símil lámina β y puentes S-S).

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La BSA NP al tener un valor de densidad menor de lo esperado (c.a. 0,99 g/cm3) (Tabla 22), cuenta con un peso molecular menor y volumen mayor a lo estimado anteriormente (115 MDa y 9,33E+05 nm3, respectivamente). Debido a esto y la disposición espacial sugerida, el número de moléculas de albúmina totales formando parte de la NP también es mayor. La cantidad de albúminas en superficie no varía debido a que el número de ellas depende exclusivamente del radio de la BSA según el modelo de la cápside icosaédrica viral.

La NP cuenta con una estructura esferoide en donde, si bien se trata de una estructura maciza, en donde las moléculas de BSA se encuentran agregadas, hay zonas en donde la agregación proteica permite espacios más laxos (Esquema 25a). En otras palabras, la esfera cuenta con regiones de gran concentración de agregado proteico, mientras que también presenta regiones en donde hay más espacio entre las moléculas de proteína (Esquema 25b). En base a los datos experimentales obtenidos el modelo más acertado sobre cómo se encuentran organizadas las moléculas de BSA en la NP sería un punto medio entre los modelos A y B anteriormente propuestos.

Esquema 26 Se encuentra representado el modelo de BSA NP, tomando como base los resultados de

cálculos de la densidad en forma experimental.

Las BSA superficiales representan sólo un 21 % del total. Es decir, la NP concentra la mayor cantidad de albúmina en su capa interna (core). Esto refuerza la idea de una BSA NP maciza con diferentes regiones de concentración proteica.

El porcentaje de moléculas superficiales que tiene expuesto el grupo SH es solamente un 10 %, mientras que el 57 % de los grupos NH están expuestos. Estos valores sugieren que durante la BSA NP existe la posibilidad de interacción entre sus grupos

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aminos con grupos sulfhidrilos. Al tener solo un 2 % de CO superficiales, se considera que el estado “nativo” de oxidación de la NP es despreciable. La ventaja está que es posible su reconocimiento por los agentes de opsonización en los organismos. Dichos agentes reconocen con mayor facilidad aquellas proteínas con elevado nivel de oxidación (indicador de vejez en la molécula).

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Conclusión

En base a los resultados obtenidos sobre el ensamblado de las BSA NPs y valores obtenidos de sus características intrínsecas de forma experimental se puede inferir que:

 Las BSA NPs se encuentran conformadas por dos capas de moléculas de albúmina: una externa en donde las moléculas de la proteína están unidas por fuerzas débiles, siendo separadas fácilmente, y otra interna, en donde las moléculas de albúmina están unidas intermolecularmente por fuerzas más fuertes, siendo difícil su separación.

 Las BSA NPs son estructuras esferoides con un diámetro hidrodinámico de 70 nm, rigiéndose por Ley de Bravais como una esfera rígida. Su densidad es de 0,99 g/cm3 en una dispersióntampón de PBS 30 mM, pH 7,0, con un total de 1710 moléculas de albúmina en su composición. Su peso molecular es de 115,23 MDa.

 Las BSA NPs tienen en su composición 22 % de estructura secundaria lámina – β contra el 7 % de esta misma estructura en la BSA. Las uniones intermoleculares se encuentran en parte en esta estructura.

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campo, mucho más interesante, de la invención humana."

[Un mundo felíz, Aldous Huxley. Capítulo I. 1932, Random House. Londres]

Parte II

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