REGGAE CONCIENCIA Providencia

10 x PCR Puffer (Promega) 5 µl

10 mM dNTPs 1 µl

attB1 internal for 10 µM 1 µl attB2 internal rev 10 µM 1 µl Pfu Polymerase (Promega) 1 µl Template DNA 200ng 8 µl

H2Obidest Ad 50 µl

2. PCR-Reaktionsansatz:

10 x PCR Puffer (Promega) 5 µl

10 mM dNTPs 1 µl

attB2 internal rev 10µM 1 µl Pfu Polymerase (Promega) 1 µl Aus dem ersten PCR Ansatz 5 µl

H2Obidest Ad 50 µl

Für die PCR wurden folgende Programme verwendet: 1. PCR

2. PCR

2.2.8.10

Rekombinationsklonierung

DNA-Fragmente, die entsprechende Rekombinationssequenzen des Phagen λ (att-sites) enthiel- ten, wurden mittels Rekombinationsklonierung mit Hilfe des Gateway-Systems (Invitrogen) kloniert. Diese erfolgte in zwei Schritten. Im ersten Schritt wurde ein PCR-Produkt, welches attB-sites ent- hielt, mittels „BP–Reaktion“ in den attP-sites tragenden Vektor pDONR 207 rekombiniert. Dabei entstanden flankierende att–sites. Der entstandene Vektor wurde nach der Invitrogen-Nomenklatur pENTER genannt. Das Reaktionsprodukt wurde in E. coli Bakterien transformiert und das Plasmid anschließend mittels DNA Präparation isoliert. Die entstandenen pENTER (Entry) Klone wurden durch Sequenzierung mit dem Primer DONR-F überprüft. Im zweiten Schritt wurden die ORFs von Y. enterocolitica aus dem pENTER-Vektor mittels LR-Reaktion in einen attR-site tragenden Ziel- vektor (Destinations-Vektor, pDEST) rekombiniert und das Rekombinationsprodukt in E. coli Bak- terien transformiert. Die Ansätze für beide Reaktionen wurden bei Raumtemperatur für 2,5 h inku- biert. Anschließend wurden die jeweiligen Klonasen mit 2 µl Proteinase K bei 37 °C für 10 min inaktiviert. Von den Reaktionsprodukten wurden jeweils 5 µl für die Transformation von kompeten- ten E. coli DH5α verwendet. Die Reaktionen setzen sich folgendermassen zusammen:

95 °C 2 min 95 °C 52°C 72 °C 30 sec 30 sec 1 kb = 2 min x15 95 °C 2 min 95 °C 52°C 72 °C 30 sec 30 sec 1 kb = 2 min x15

PCR-Produkt 200 ng pDONR207 150 ng BP-Clonase Mix 1 µl H2Obidest Ad 5 µl LR-Reaktionsansatz: pENTER 150 ng pDEST (Zielvektor) 150 ng LR-Clonase Mix 1 µl H2Obidest Ad 5 µl

2.2.8.11

Zielgerichtete Mutagenese

Um Punktmutationen oder den Austausch von wenigen Basenpaaren in DNA-Abschnitte einzufü- gen, wurde das QuickChange Site directed mutagenesis Kit (Stratagene) nach Herstellerangaben verwendet. Für den Entwurf der Primer wurde das QuickChange Primer Design Programm ver- wendet (http://www.stratagene.com/qcprimerdesign). Für die Transformation nach der Mutagenese wurden chemisch kompetente E. coli DH5α verwendet.

2.2.8.12

Sequenzierung von DNA

Um die klonierten Plasmide auf die Korrektheit ihrer Sequenz zu überprüfen, und zur Identifikation von Sequenzen, die mittels Y2H-Screen gegen cDNA Genbanken gefunden wurden, wurden durch folgende Einrichtungen Sequenzierungen durchgeführt:

AGOWA GmbH, Berlin GATC GmbH, Konstanz

2.2.8.13

Realtime PCR-Quantifizierung von RNA-Transkripten mittels Taq-

Man™-PCR

Die Umschreibung der RNA in cDNA erfolgte mit Super-script II reverser Transkriptase (Invitrogen) nach Angaben des Herstellers. Es wurde jeweils 1 µg RNA und 250 ng Hexanukleotid Random- Primer-Mix (Promega) verwendet. Die cDNA wurde im Verhältnis 1:5 mit Wasser verdünnt. Die TaqMan-PCR wurde im ABI Prism 7000 sequence detection system (Applied Biosystems) durch- geführt. Die TaqMan-Sonden wurden der Universal Probe Library (Roche) entnommen. Um die für die Detektion eines Genes jeweils optimale Kombination aus einem spezifischen Primerpaar und einer Sonde zu entwickeln, wurde die Software Assay Design Center

(www.universalprobelibrary.com) (Roche) verwendet. Die PCR wurde mit den folgenden Parame- tern durchgeführt:

Dabei wurde nach jedem Zyklus die Fluoreszenz gemessen. Die Datenanalyse erfolgte mit der ABI Prism 7000 Software, welche einen Ct-Wert für jede Reaktion berechnet. Um die Unterschiede in den Transkriptmengen eines gegebenen Gens in unterschiedlichen Zelllinien oder unter unter- schiedlichen Bedingungen zu berechnen, wurde pro Ct-Wert eine Verdoppelung der Transkript- menge angenommen. Der Mengenfaktor (x) wurde also durch die Formel x=2 -∆ct angenähert. Für die RT-PCR wurde folgender Reaktionsansatz verwendet:

cDNA 5 µl

TaqMan Universal Master Mix 12,5 µl 10 µM forward Primer 2 µl 10 µM reverse Primer 2 µl

TaqMan Sonde 0,25 µl

ROX Referenzfarbstoff ( Invitrogen) 0,5 µl

H2Obidest 2,75 µl

2.2.9 Mikroskopische Methoden

2.2.9.1

Immunfluoreszenz- und DAPI-Färbung in Säugerzellen

Die zu analysierenden Säugerzellen wurden in gewünschter Dichte auf Deckgläsern ausgesät und je nach Fragestellung behandelt (unbehandelt, DNA-Transfektion mit oder ohne Infektion mit Bak- terien). Zur Fixierung wurden die Zellen 15 min lang bei RT in einer Lösung aus 2% Formaldehyd in PBS inkubiert. Das Entfernen der Fixierlösung erfolgte durch drei fünfminütige Waschschritte mit PBS. Danach wurden die Zellen 5 min lang in eiskaltem PBS mit 0,5% TritonX-100 permeabilisiert und wieder dreimal mit PBS gewaschen. Die Markierung mit den Primärantikörpern (in PBS ver- dünnt) erfolgte anschließend über einen Zeitraum von 10 min. Nach Entfernung der Primärantikör- per durch dreimaliges Waschen mit PBS wurden die Zellen mit den in PBS verdünnten, Fluoroch- rom-gekoppelten Sekundärantikörpern inkubiert und anschließend erneut gewaschen. Zur Darstel- lung der Zellkerne wurde ein Inkubationsschritt (5 min, bei RT) mit dem Fluorochrom DAPI durch- geführt, welches spezifisch DNA anfärbt. Die Deckgläser mit den Zellen wurden anschließend dreimal mit PBS gewaschen, dann einmal zur Entfernung von Salzen von den Deckgläsern vor-

94 °C 12 min

95 °C 60°C

20 sec

Mounting Medium (Dianova) auf Objektträger gebettet. Die Mikroskopie wurde am Fluoreszenz- mikroskop LEICA DM 400B durchgeführt und die Ergebnisse mit Hilfe der zugehörigen Digitalka- mera LEICA DF C360 FX und der Software LEICA AF 6000 dokumentiert.

2.2.10 Hefe-2-Hybrid-Methoden

2.2.10.1

Das Hefe-2-Hybrid-System

Das Hauptprojekt dieser Doktorarbeit war die Identifikation der PPI mittels des Y2H Systems. Aus diesem Grund wird das Y2H System in diesem Methodenteil näher beschrieben. Beim Y2H Sys- tem handelt es sich um eine Technik der Molekularbiologie zur Aufklärung von PPI. Das Y2H Sys- tem beruht auf der transkriptionsaktivierenden Wirkung des Gal4-Proteins aus S. cerevisiae, wel- ches aus einer DNA-bindenden (BD) und einer Aktivierungsdomäne (AD) besteht. Diese beiden Domänen können nur dann eine Aktivierung der Transkription bewirken, wenn sie in räumliche Nähe zueinander kommen. Die für ein Yersinia-Protein kodierende DNA wurde in ein Gal4-BD kodierendes Fängerplasmid pGBKT7 kloniert, den sogenannten Bait-Vektor, so dass es anschlie- ßend als Gal4-BD Fusionsprotein exprimiert werden konnte. Für den intrabakteriellen Y2H-Screen wurden Y. enterocolitica Gene ausserdem in ein Prey-Plasmid pGADT7 kloniert und als Gal4-AD Fusionsprotein exprimiert. Im Falle des Pathogen-Wirt-Screens wurde als Prey eine Mischung von Prey-Palsmiden verwendet, die in pACT2 Vektor kloniere humane cDNAs enthielten: Das pACT2 Vektor kodiert für die Gal4-AD. Bei gemeinsamer Expression der beiden Fusionsproteine in Hefen, die ein pGAL4-Reportergen-Konstrukt enthalten, werden die Gal4-AD und -BD im Falle einer In- teraktion der zu testenden Proteine in räumliche Nähe zueinander gebracht, was zur Aktivierung des GAL4-Promotors und damit zur Expression des Reportergens führt. Als Reporter der Interakti- on fungieren Gene, die entweder an der Biosynthese bestimmter Aminosäuren beteiligt sind (z.B Histidin) oder eine optische Erkennung der Interaktion ermöglichen (z. B ein nichtfluoreszierendes Substrat wird in ein fluoreszierendes Produkt umgewandelt). Im Y2H-Screen gegen cDNA Gen- bankenwurden Hefe-Stämme benutzt, denen das HIS3 Gen fehlte und die deshalb keine Histidin- Synthase produzieren konnten. Als erstes Reportergen wurde deshalb das HIS3 Gen benutzt. Im Falle einer Interaktion zwischen Prey und Bait kam es zur Synthese der Histidin-Synthase in Hefe- zellen, was den Hefen das Wachstum auf Histidinmangelmedium ermöglichte. Als zweites Repor- tergen fungierte Mel 1, welches für die α-Galactosidase kodiert. Die ins Medium hinzugefügte fluorogene Substanz 4-Methylumbelliferyl-alfa-D-galactosid wird durch die α-Galactosidase in Galactase und 4-Methylumbelliferyl gespalten. Das dabei entstehende Fluoreszenz-Signal kann gemessen werden und erlaubt somit die quantitative Bestimmung der Interaktion.

Abbildung 10: Prinzip des Y2H Systems. Durch Interaktion von Prey- und Bait- Proteinen kommt