Regionalización anteroposterior de la placa alar de m

Los datos genoarquitectónicos obtenidos muestran que a partir de E12.5 es posible individualizar los territorios alares de m1 y m2 en el ratón (datos equivalentes en el pollo, estadios HH27/28). Estos territorios anteroposteriores incorporan según nuestro estudio un quinto componente, adicional a los ya postulados previamente. El dominio más rostral en m1 se conoce como griseum tectalis (TG; ver García-Calero y col., 2002; Puelles y col., 2012), el cual se sigue del colículo superior (SC; ambos son centros retinorecipientes); caudalmente a éste aparece primero el dominio intercolicular (In), una formación somatosensitiva, y tras él el colículo inferior (IC), una estación de relevo acústica. Los territorios alares del mesencéfalo incluyen asimismo en su extremo caudal el preístmo (PI), que se localiza en la placa alar de m2 (Hidalgo-Sánchez y col., 2005; Puelles y col., 2007; 2012).

En la literatura neuroanatómica se suele ver una versión simplificada de este territorio, en la que se menciona exclusivamente a los dos colículos. El TG solía describirse en la literatura clásica como ‘núcleo pretectal posterior’, atribuyéndolo erróneamente al pretecho, aunque esta formación se localiza justamente caudal a la comisura posterior (un efecto de la confusión existente respecto al límite mesencéfalo-diencefálico; revisión en García-Calero y col., 2002; Puelles y col., 2012). Según nuestro nuevo modelo se generarían anteroposteriormente no menos de cinco dominios alares, como producto de los procesos de regionalización del mesencéfalo controlados por el organizador ístmico. En realidad, estas cinco formaciones identificadas con nombre propio representan solamente el componente dorsolateral –siempre el de mayor tamaño relativo- del patrón de subdivisión dorsoventral que se discutirá más adelante (Fig. 4.15). Por lo tanto, la placa alar mesencefálica presenta diversos otros derivados, situados ya sea dorsalmente o ventralmente a cada uno de los derivados mayoritarios. En su mayoría estos componentes son muy poco conocidos.

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El gen Esrrb aparece expresado exclusivamente en el manto del griseum tectalis (TG), donde Meis2 comienza a disminuir su expresión a partir de E12.5, y donde predomina asimismo la expresión de calretinina o Calb2. Otros genes tales como Tcf7l2, que inicialmente no se expresan en este territorio, muestran una masiva expresión en el manto del TG en estadios postnatales, con detalles diferenciales en relación a los territorios pretectales o del colículo superior adyacentes (rostral y caudal, respectivamente). Finalmente, también la expresión de Foxp1, Foxp2, Gata3 y Lhx2

presenta una distribución en el manto de TG que es característica y típica para este dominio. El gen Ntng2 es otro marcador que se expresa intensamente en el TG (Figura 10.2 en Puelles et al., 2012). La abundancia de marcadores más o menos selectivos para el TG contrasta con la escasa atención que ha recibido esta región mesencefálica en el pasado, y continúa recibiendo en la actualidad. El griseum tectalis es una formación retinorecipiente poco estudiada que es identificada en la literatura de mamíferos como “núcleo pretectal posterior” (su parte más profunda) y “núcleo del tracto óptico” (parte superficial); existe una estructura estratificada homóloga en el lóbulo óptico de las aves (Puelles y col., 1991; Caballero-Bleda y col., 1992; Díaz y col., 2000; Martinez-de-la- Torre, 1995; García-Calero y col., 2002; Puelles y col., 2007; Puelles y col., 2012), así como en reptiles y anfibios. Hasta este momento no se había realizado ningún estudio sistemático que definiera molecularmente los límites de este territorio durante el desarrollo y estadios postnatales en roedores, siendo esta información clave para definir en diseños experimentales las singularidades propias de esta región retinorecipiente. Nuestros datos genoarquitectónicos sobre el colículo superior muestran que a partir de E12.5 se observa expresión de Lim1, Gata3, Bhlhb4, Gsh1, Tal1 y Foxb1 en esta formación. Estos genes se expresan tanto en el manto del colículo superior como en el del griseum tectalis, pero están ausentes en el manto del colículo inferior. Observando únicamente estos patrones no es posible diferenciar GT de SC en este estadio, pero combinando marcadores exclusivos del TG tales como Esrrb se puede apreciar un límite bien definido. Tanto GT como SC son estructuras retinorecipientes, a diferencia del colículo inferior (IC), que está involucrado en la vía acústica ascendente al tálamo (Puelles y col., 2012). El significado posible de la compartición por parte del GT y del SC de algunos códigos moleculares podría relacionarse entre otros aspectos con la generación de los códigos de efrinas y sus receptores, necesarios para el establecimiento de las correctas proyecciones retinotópicas sobre ambas regiones mesencefálicas

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(Scicolone y col., 2009). Estudios experimentales en ratones transgénicos con una dosis reducida del morfógeno FGF8 (generado por el organizador ístmico) mostraron que hay una correlación entre el nivel de FGF8 y los dominios rostrocaudales mesencefálicos que son generados. Se requieren dosis mayores para la especificación de los territorios más caudales. Por tanto, una clara disminución de la dosis de Fgf8 tiene como consecuencia la pérdida del cerebelo, de la región preístmica y del colículo inferior, conservándose y aumentando de tamaño en cambio el SC y el TG (Basson y col., 2008; no hay datos para el área ICo). Estos datos sugieren una posible activación común de una red génica compartida por el TG y el SC, resultante de posibles niveles similarmente bajos de FGF8 percibidos inicialmente por ambos territorios.

Como resultado de nuestro estudio genoarquitectónico, en contexto con otros datos en la literatura, postulamos la existencia de un nuevo dominio histogenético anteroposterior del mesencéfalo alar, que hemos denominado área intercolicular; ésta aparece intercalada entre los colículos superior e inferior, formando un delgado territorio transicional entre ambos. En secciones horizontales, en las que se puede observar en detalle la transición entre los colículos superior e inferior, se aprecia en esta posición la presencia de un dominio genoarquitectónicamente diferente en todos los estratos de su dimensión radial y con evidente organización laminar de sus derivados neuronales. Se ha descrito en diversos mamíferos neuronas dispuestas lateralmente al plano de las fibras de la comisura intercolicular, que forman un acúmulo denominado núcleo

intercolicular (ICo). Se sabe que éste recibe selectivamente aferencias somestésicas

desde los núcleos de los cordones posteriores del bulbo y la médula espinal cervical. En vertebrados no mamíferos se ha identificado un área intercolicular de parecida posición transicional entre los centros visual y auditivo principales, que parece ser somestésica, en particular receptora de información que alertaría al animal de estímulos vibratorios (Blomqvist y col., 1990; Künzle, 1993; Pritz y Stritzel, 1989; RoBards y col., 1976; Schroeder y Jane, 1976). Estudios en gatos en los que se analizaron estimulos visuales, auditivos y tactiles mostraron que el núcleo intercolicular recibe exclusivamente modalidades somatosensoriales, a diferencia del colículo superior, que recibe señales visuales, auditivas y somatosensoriales (en distintos estratos), o el colículo inferior, cuyas aferencias son auditivas y somatosensoriales (Blomqvist y col., 1990). Los estudios previos por tanto han definido el núcleo intercolicular como un centro específicamente somatosensitivo mesencefálico, que podría tener un carácter funcional

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más sensorial que sensorimotor (RoBards y col., 1976; Blomqvist y col., 1990). En términos de RoBards et al. (1976), la modalidad somestésica estaría representada anatómicamente en el mesencéfalo de una forma al menos tan extensa como la visión o la audición; estos autores propusieron en aquel momento un mesencéfalo alar con al menos tres porciones (colículo superior, área intercolicular y colículo inferior), si bien el área intercolicular era concebida solamente como un núcleo aislado. Nosotros proponemos que el núcleo ICo clásico es la parte más visible de un área histogenética completa alar (nuestro ICo), cuyos otros derivados estarían repartidos en diversos subdominios dorsoventrales (el núcleo ICo pertenecería al subdominio mayoritario dorsolateral) y sus respectivos estratos. Este concepto parece más parsimonioso que imaginar en el campo alar del mesencéfalo una estructura nuclear aislada extra, como una isla difícil de explicar causalmente en el contexto de los colículos superior e inferior. Desafortunadamente, tanto el área como el núcleo intecolicular han recibido escasa atención en el ratón (ver revisión en Puelles y col., 2012).

Según se desprende de nuestra conjetura, además del núcleo intercolicular, presente exclusivamente en el subdominio DL, en el que también se encuentran los colículos, cabría esperar, primero, otros derivados del mismo subdominio distribuidos en estratos dentro de DL, incluyendo una región PAG con identidad molecular propia, así como otras poblaciones de posiciones respectivamente profunda y superficial al núcleo intercolicular propiamente dicho (tales regiones también muestran poblaciones con sensibilidad táctil; Blomquist y col., 1990). En segundo lugar, el área intercolicular además debería tener otros subdominios dorsoventrales de posición respectiva dorsal interna, dorsal externa y ventrolateral, que se añadirían al subdominio dorsolateral que hemos estado discutiendo (cada uno con sus respectivos estratos). Algunas de nuestras observaciones con ciertos marcadores génicos, así como la idea de que el subnúcleo externo del torus semicircular de las aves pueda ser un componente del área ICo (ver más abajo), apoyan estas predicciones, si bien es necesaria una investigación específica para examinar con más atención los detalles implicados.

En el caso del colículo inferior (IC), es también a partir de E12.5 cuando hay evidencia molecular que permite individualizarlo genoarquitectónicamente. A partir de E14.5, ciertos genes, como Foxp1, Pax7 o Tfap2B, se caracterizan por perder su expresión previa en el manto del colículo inferior (IC). Así mismo, hemos hallado marcadores – p.ej. el Npy- que se expresan predominantemente en el manto del IC. Los marcadores

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génicos identificados en esta región serán útiles para comprender las bases causales que llevan a la especificación de sus diversas poblaciones celulares, insuficientemente descritas en la actualidad, siendo además herramientas disponibles para interpretar lo que ocurre con los derivados mesencefálicos en las distintas líneas transgénicas en las que se altera el organizador ístmico (Puelles y col., 2012; Ferran y Puelles 2012; Puelles 2013). Varios de los marcadores moleculares presentes o ausentes en el colículo inferior muestran un patrón similar en la región preístmica (por ej. ausencia de expresión de

Pax7, junto a expresión de Npy), aun cuando cada territorio tiene facetas moleculares y estructurales propias que lo distinguen. Esto podría tener alguna relación con efectos comunes mediados por la cercanía al organizador ístmico, ya que la concentración de FGF8 debe ser más alta en este territorio caudal del mesencéfalo.

Hemos identificado asimismo molecularmente la región preistmica (PI) en el ratón, a partir de E12.5. Ésta pertenece al mesómero m2, que representa un estrecho anillo transverso completo del tubo neural intercalado entre el m1 y la región ístmica rombencefálica (donde se forma el organizador ístmico). Consistentemente con la idea de que m2 es un componente del mesencéfalo, el preistmo presenta el marcador general mesencefálico, el factor de transcripción Otx2. De hecho, ya desde E13.5 su señal es más importante en el PI que en el IC (donde progresivamente se pierde). El preístmo se corresponde con la región alar de m2, que es su parte más desarrollada (donde sobresalen los núcleos superficiales subbraquial y sagulum, así como el núcleo cuneiforme a nivel intermedio; Puelles y col., 2012). La región basal correspondiente se intercala en el estrecho intersticio existente entre el núcleo oculomotor común (m1) y el núcleo troclear (ístmo) (Hidalgo-Sánchez y col., 2005; Puelles y col., 2012; Puelles, 2013). La región preístmica fue identificada por primera vez mediante métodos genoarquitectónicos y de embriología experimental en embriones de pollo (Hidalgo- Sánchez y col., 2005).

Nuestros datos indican que Six3 aparece tempranamente como marcador selectivo del PI, si bien en fases más avanzadas del desarrollo parece que una importante población de neuronas Six3-positivas invade tangencialmente el IC desde el PI (fenómeno también observado en el pollo). Los genes Tcf7l2 y Tfap2B que caracterizan la placa alar de m1 están selectivamente ausentes en PI. En cambio, los genes Calb2, Tal2, Foxp1, Gata3 y

Lhx2 presentan marcada expresión en PI, con distribución diferencial con relación a su señal en IC (así como en el rombencéfalo). Finalmente, ciertos genes están expresados

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en el rombencéfalo prepontino y extienden su dominio de expresión al preistmo, con o sin interrupción en el límite rombo-mesencefálico. Es el caso bien conocido de Pax8,

Pax5 y Pax2 (Hidalgo-Sánchez y col., 2005). Meis2 marca intensamente los derivados del ístmo y del IC, pero deja sin marcar las poblaciones del manto del PI. Todos estos datos nos permiten confirmar sólidamente la existencia en mamíferos del preistmo como el dominio mesencefálico alar más caudal (Puelles y col., 2012). Con los datos presentes, ahora este territorio es perfectamente diferenciable tanto del colículo inferior como del istmo, dada su peculiar identidad genoarquitectónica.

5.3 Divisiones dorsoventrales de la placa alar mesencefálica.

Tal como se describió previamente, la placa alar mesencefálica presenta cinco divisiones o dominios anteroposteriores, cuyo origen y especificación sin duda están relacionados en gran medida, si no totalmente, con la acción señalizadora del organizador ístmico (Basson y col., 2008). Adicionalmente, estas divisiones alares presentan cada una ciertas particiones dorsoventrales, que distinguimos genéricamente como subdominios, las cuales aparentemente emergen como consecuencia de acciones inductivas dorsoventrales de tipo mutuamente antagónico mediadas por las placas del techo y del suelo (Puelles y col., 2012; Puelles, 2013). Puelles y col. (2012) postularon tentativamente un modelo de subdivisión dorsoventral en el mesencéfalo constituido por tres subdominios alares (a través de las diversas divisiones anteroposteriores). De dorsal a ventral éstos fueron denominados subdominios dorsal, dorsolateral y ventrolateral. Han sido propuestos otros modelos donde se postulan menos particiones dorsoventrales alares. Según el modelo de divisiones dorsoventrales planteado por Nakatani y col. (2007), modificado luego por Kala y col. (2009), existirían dos dominios de este tipo, identificados por estos autores como m1 y m2 (desafortunadamente, estos nombres se solapan totalmente con las siglas de los mesómeros 1 y 2, por lo cual nosotros nos referiremos a estos conceptos usando mayúsculas, o sea, M1 y M2). M1 se caracteriza por la expresión de Pax7 y M2 por la ausencia de este marcador y la expresión de

Nkx2.2 en el manto, entre otros marcadores.

Como resultado de nuestro estudio genoarquitectónico, nosotros hemos podido definir cuatro dominios alares dorsoventrales en lugar de los tres que esperábamos de acuerdo con el esquema basado en Puelles y col. (2012). Esencialmente, encontramos

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evidencia de que el subdominio dorsal de estos autores (no distinguido por Nakatani y col., 2007 o Kala y col., 2009) debe ser dividido en partes interna y externa con relación al plano medio, dando así de dorsal a ventral los subdominios dorsal interno, dorsal externo, dorsolateral y ventrolateral.

Subdominios dorsales.

La placa del techo se puede individualizar durante la gestación y los estadios postnatales mediante marcadores tales como Lmx1b y Lmx1a (Nakatani y col., 2007). Lateralmente a la región del techo que expresa Lmx1b encontramos una pequeña región Zic1 positiva, pero Pax7-negativa, a la que denominamos subdominio dorsal interno (DI). Adyacente al DI se localiza otra pequeña región, el subdominio dorsal externo (DE), que se caracteriza por expresar tanto Zic1 como Pax7. Nakatani y col. (2007) y Kala y col. (2009) afirman en su modelo que la expresión de Pax7 toca la placa del techo; sin embargo, no muestran imágenes de la zona correspondiente, y nuestros datos no corroboran dicha conclusión, ya que DI no expresa Pax7. Pensamos que el territorio

Pax7-positivo al que estos autores se refieren corresponde básicamente a nuestros subdominios DL y DE, y han interpretado erróneamente como placa del techo un territorio más amplio que el que reconoce Lmx1b, correspondiente al techo más DI. Por otra parte, Puelles y col. (2012) propusieron la existencia de un dominio dorsal basándose principalmente en una columna longitudinal de neuronas paracomisurales que es adyacente a la placa del techo y es distinguible histológicamente de los derivados del dominio dorsolateral (griseum tectalis, colículo superior, area intercolicular y colículo inferior). Esta columna paracomisural tectal se extiende a lo largo de la totalidad de m1, y probablemente existe una formación análoga de menor tamaño en m2. Según la interpretación de Puelles y col. (2012), los estratos central e intermedio del dominio dorsal contienen respectivamente las columnas ventral y dorsal de los núcleos paracomisurales tectales (TPCV, TPCD). Estos núcleos fueron descritos inicialmente bajo el nombre de columnas longitudinales tectales dorsal y ventral

(Saldaña y col. 2007; Aparicio y Saldaña, 2013). La columna dorsal (TPCD) está constituida exclusivamente por neuronas gabaérgicas, que están dedicadas a inhibir masivamente ciertos núcleos talámicos de tipo acústico (Aparicio y Saldaña, 2013). El TPCV recibe diversas proyecciones del sistema auditivo, basicamente del núcleo paraolivar superior, del colículo inferior y de la corteza auditiva primaria (Saldaña y col.

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2007; Viñuela y col., 2011; Aparicio y col., 2010; Aparicio y Saldaña, 2013). Existe la posibilidad, no obstante, de que TPCV derive del subdominio DI y que TPCD derive del subdominio DE, obedeciendo su aparente disposición una encima de la otra a deformación morfogenética debida a la presión ejercida por el desarrollo más masivo del subdominio DL adyacente. Debido a que estas columnas han sido caracterizadas anatómica-, hodologica- y funcionalmente en roedores adultos, el posible desplazamiento relativo de partes de su manto en dirección dorsal (DE sobre DI) durante el desarrollo avanzado ha permanecido oculto. Tal hipótesis puede ser confirmada examinando la estructura de la glía radial en las columnas paracomisurales. Entre los datos más relevantes que hemos observado en estadios postnatales destaca la expresión selectiva de Penk1 en la columna paracomisural dorsal (TPCD).

Subdominio dorsolateral.

Este subdominio mayoritario en la región alar mesencefálica ha sido ya objeto de comentario más arriba, en relación a sus derivados gris tectal, colículo superior, area intercolicular, colículo inferior y preistmo.

Subdominio ventrolateral.

El subdominio VL es claramente diferenciable de su vecino inmediato (DL) por su histogénesis diferencial, si bien se corresponde con una zona del manto alar que ha recibido escasa atención (núcleo mesencefálico profundo en algunos trabajos clásicos comparados; región laterorubral de la formación reticular). Esto aparentemente es debido a que la mayor parte del manto VL adopta una diferenciación de aspecto reticular (formación reticular mesencefálica lateral, o laterorubral), en la que no es posible reconocer masas nucleares discretas. No obstante, su territorio profundo periacueductal ha sido repetidamente reconocido como poseedor de propiedades funcionales y quimioarquitectónicas características. Notablemente, la inyección de aminoácidos excitatorios en esta región periacueductal produce reacciones de defensa pasiva (quiescencia, hiporeactividad, hipotensión, bradicardia), y la misma región aparece vinculada a la producción de efectos analgésicos de tipo opioide (células con endorfinas). Este tipo de reacción se produce normalmente cuando el animal se ve

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afectado por circunstancias adversas inescapables de tipo ya sea físico (lesión) o psicológico, tales como una lesión traumática (pérdida de sangre, dolor intenso) o stress crónico (por ejemplo, por situaciones de derrota social repetida). El animal se queda quieto, o simula estar muerto. Esto contrasta con las respuestas de defensa activa que caracterizan la activación de la formación periacueductal profunda a DL, típicas de situaciones en las que el animal se siente amenazado o atacado de forma escapable, o sea, en las que lucha, o indica su disposición a luchar (Keay and Bandler, 2004 [Periaqueductal gray. Chapter 10 in Paxinos, G. The Rat Nervous System, Academic Press, San Diego. pp.243-257]).

5.4 Genoarquitectura de los estratos del colículo superior.

Existe poca información en la literatura sobre esta temática, por lo cual resumiremos nuestras observaciones.

Una marcada expresión de Bhlhb4 aparece desde E12.5 en una población periventricular del colículo superior, correspondiendo a la prospectiva sustancia gris periacueductal (PAG). Datos sobre este marcador en la colección del Allen Brain

Research Institut

células periventriculares que forman parte del PAG (también presentes en el PAG de los dominios dorsal interno, dorsal externo y ventrolateral) continúan expresando Bhlhb4. Puede ser que esta población coincida con ciertas células NAPDHd-positivas descritas en este lugar (Keay y Bandler, 2004; su Fig.3).

Hemos observado que, además de la expresión de Tcf7l2, Calb2, Penk1, Meis2, ParvB y Tac1 en el PAG adulto correspondiente al colículo superior, existe una distribución preferencial de estos marcadores en las distintas capas que componen sus tres estratos (central, intermedio y superficial). Tcf7l2 y Calb2, que también se

transcriben de forma marcada en el gris tectal, aparecen expresados significativamente en los estratos CS central e intermedio. Penk1 y Meis2 muestran un patrón similar. La señal de ParvB destaca en los estratos central y superficial, mientras que la de Tac1 se restringe esencialmente al estrato superficial.