Resistencia a los inhibidores de la polimerasa

Aunque el gen NS5B es menos variable que otras partes del genoma del VHC, el polimorfismo genético y la mutación también puede limitar la eficacia de inhibidores específicos de NS5B (Le Pogam et al. 2008, Gaudieri et al. 2009, Beaulieu et al. 2009, Shi et al. 2008). El potencial de emergencia de resistencias está afectado por múltiples factores que incluyen si el inhibidor es alostérico o análogo de nucleósido. Los IAN normalmente actúan en el sitio catalítico de la polimerasa NS5B. Se ha estudiado en un modelo de replicón las sustituciones que confieren resistencia a los IAN (S282T, S15G, R222Q, C223Y, C223H, L320I, V321I) (De Francesco et al. 2007, Thompson et al. 2009, Lam et al. 2011), y se requiere una combinación de al menos tres cambios (por ejemplo: S15G/C223H/V321I) para conferir un alto nivel de resistencia (Sofia et al. 2012) Además, los IAN poseen una actividad antiviral pangenotípica y muestran una alta barrera genética para la aparición de la resistencia (McCown et al. 2008) y no se han observado, hasta el momento, mutaciones de resistencia en monoterapia (Le Pogam et al. 2010, Pawlotsky et al. 2012a) o en combinación con otros AAD (Gane et al. 2010, Le Pogam et al. 2012, Najera et al. 2013), pero si con peg-IFN-α/RBV, aunque en muy pocos pacientes Además, la utilización de IAN en combinación con peg-IFN-α/RBV, se ha identificado mutaciones de resistencia en muy baja frecuencia (Tong et al. 2014a; 2014b, Gane et al. 2014b). Los IAN son por lo tanto los fármacos más prometedores debido al número limitado de mutaciones de resistencia descrito (Gelman y Glenn 2011), y por la baja frecuencia de virus resistentes que circulan en la población (Le Pogam et al. 2008, Sentandreu et al. 2010, Rong et al. 2010).

En comparación con los IAN, los INN exhiben diferentes perfiles de resistencia en función del sitio de acción en la polimerasa NS5B. Al contrario que con los IAN las sustituciones asociadas con resistencia a INN son numerosas, y se encuentran principalmente en los cuatro sitios alostéricos A, B, C y D. Algunos cambios particulares pueden ser extremadamente importantes para la resistencia, por ejemplo la mutación en el codón M423V/I, aumenta 31 veces la resistencia a la droga AG-02154 (Shi et al. 2008). También las mutaciones secundarias pueden aumentar los perfiles de resistencia. Por ejemplo, cuando se combina algunas de las siguientes sustituciones T19P,

M71V, M423V ó A442T, con A338V se provoca un aumento de hasta 17 veces la resistencia a tiopenos y dihidropironas (Howe et al. 2006). La sustitución C316N es frecuente en el VHC subtipo 1b (Le Pogam et al. 2008) y junto con Y448H, D559G ó Y555C pueden aumentar hasta 30 veces la resistencia a los benzofuranos. Las respuestas variables ante los diferentes INN puede deberse por tanto a polimorfismos naturales del virus que implica diferente susceptibilidad basal (Sun et al. 2011).

JUSTIFICACION

La infección crónica por el VHC sigue siendo un grave problema de salud pública a nivel mundial, afectando a 200 millones de personas (unas 900.000 en España) y ocasionando unas 10.000 muertes al año. En España, además de ser la principal causa de hepatitis crónica, cirrosis y carcinoma hepatocelular, la infección es la indicación más frecuente de trasplante hepático.

El tratamiento de la infección crónica basado sólo en peg-IFN-α/RBV tiene un éxito en el 40% de los pacientes y está asociado a efectos secundarios a veces graves, que pueden llevar a la parada del tratamiento. La reinfección del injerto post-trasplante es universal, ocasionando una hepatitis más agresiva y más difícil de tratar con peg-IFN-α /RBV, con efectos adversos muy frecuentes. En pacientes con enfermedad avanzada o trasplantados, el acceso a los nuevos tratamientos con ADD es fundamental para mejorar su pronóstico y detener la progresión de la enfermedad. En España, para aquellos pacientes con infección por VHC genotipo 1, el tratamiento estándar incluye IP de primera (Telaprevir ó Boceprevir) ó de segunda generación (Simeprevir) con unas tasas de respuesta del 75-85%, aunque en los últimos años, se han desarrollado otros AAD (como el Sofosbuvir ó el Daclatasvir) que, en combinación, aumentan la tasa de éxito del tratamiento hasta el 95% incluso en ausencia de interferón. Sin embargo, aunque la tasa de curación con AAD es mayor, se ha observado una menor eficacia en ciertos pacientes, debido a mutaciones de resistencia del virus, bien por selección de mutaciones pre-existentes, ó bien por emergencia durante la administración AAD, Además, en pacientes trasplantados inmunodeprimidos, el VHC puede estar sometido a una menor presión selectiva, y presentar una variabilidad genética diferente en relación a pacientes inmunocompetentes. Por tanto es importante determinar la variación natural del genoma del VHC y su posible impacto en el tratamiento con nuevos AAD en estos grupos de pacientes, para prevenir potenciales fallos terapéuticos y optimizar los futuros regímenes terapéuticos, escogiendo los AAD más adecuados para cada caso.

OBJETIVOS

Objetivo general e hipótesis.

El objetivo de esta tesis doctoral es analizar la variabilidad genética en el gen NS3 y NS5B del VHC (diana de AAD inhibidores de la proteasa y polimerasa viral) en distintos aislados naturales del subtipo 1b obtenidos de pacientes con infección crónica, partiendo de la hipótesis de que ya se encuentran en circulación virus resistentes a estos nuevos fármacos.

Objetivos específicos

1. Poner a punto la secuenciación de la proteasa NS3 y la polimerasa NS5B del VHC en muestras clínicas de pacientes con hepatitis crónica C.

2. Poner a punto el estudio de mutaciones minoritarias de resistencia a AAD mediante clonación y secuenciación, para detectar poblaciones de la “cuasiespecie” del virus indetectables mediante secuenciación directa y que podrían ser seleccionadas durante el tratamiento con AAD.

3. Determinar la prevalencia de polimorfismos naturales relacionados con resistencia a AAD en la proteasa NS3 y de la polimerasa NS5B del VHC en aislados de pacientes infectados por el subtipo 1b del virus, a dos niveles: entre pacientes e intrapaciente.

4. Evaluar la variabilidad genética natural de la proteasa y el grado de polimorfismo de la proteasa NS3 y de la polimerasa NS5B del VHC en posiciones asociadas a resistencia a AAD, en función del orígen geográfico de los aislados y de la presencia ó ausencia de inmunosupresión.

3. MATERIAL Y MÉTODOS