Muchos estudios de patogenicidad de X. citri y de otras bacterias fitopatógenas se han focalizado principalmente en la interacción posterior al ingreso de la bacteria al tejido de las plantas. Esto se debe en parte a la extensa difusión de los métodos de inoculación que depositan la bacteria artificialmente en el mesófilo, como la infiltración. La infiltración, destruye mecánicamente a las barreras constitutivas de defensa de la planta, como la cutícula y la pared celular. Las nuevas evidencias sugieren que estos procedimientos de inoculación pueden haber impedido el descubrimiento de importantes mecanismos involucrados en los estadios tempranos de la interacción del patógeno con la planta (Melotto et al., 2006).
Si bien en muchos cultivares de cítricos y géneros relacionados, se encontró que existe resistencia a la cancrosis bacteriana aún después de introducir bacterias en el mesófilo por el método de infiltración, este tipo de resistencia, conocida como resistencia del mesófilo, no es absoluta, sino cuantitativa, expresada por un bajo número de lesiones comparado con cultivares más susceptibles. Algunos genotipos que comparten esta categoría son: el 'Dalan Dan', un cultivar similar a pomelo (Citrus paradisi), el limequat (Citrus aurantifolia x Fortunella japonica) 'Lakeland', el calamondin (Citrus mitus), y las especies C. ichangensis y C. junos (Deng et al., 2009; Gochez & Canteros, 2008; Gottwald et al., 1993; Viloria et al., 2004). En este trabajo de Tesis Doctoral se ha demostrado que cuando las hojas de los cvs. 'Clemenules' y 'Okitsu' son inoculadas por el método de infiltración, no se encuentran diferencias en el desarrollo de cancros, independientemente de la edad de la hoja inoculada (Figura 4.I.2 A).
La formación de los síntomas de cancro depende de una buena adherencia y formación de biofilm en la superficie de las hojas (Rigano et al., 2007). El método de inoculación por aspersión permite que estos procesos ocurran tal como sucederían en el campo y por lo tanto, permite que actúen las barreras primarias frente a la infección de X. citri. Utilizando éste método, se demostró que X. citri coloniza la superficie de las hojas del cv. 'Clemenules' formando microlonias, particularmente sobre las uniones de las células epidérmicas y alrededor de los estomas. Las microcolonias evolucionan en el tiempo a biofilms maduros y finalmente desarrollan cancros. En contraste, en la superficie de las hojas de 'Okitsu' se observa una clara reducción en el número de bacterias adheridas y en la formación de biofilm luego de 7 dpi (Figura 4.I.4). En consecuencia, las diferencias en las propiedades de la superficie de las hojas entre ambos cultivares de mandarino influencian el crecimiento epifítico, la adherencia y la formación de biofilm de X. citri. Específicamente, la superficie de las hojas de 'Okitsu' parece interferir con factores bacterianos que son clave para la colonización de X. citri y el posterior establecimiento de la enfermedad, cumpliendo una función de barrera de defensa primaria frente al patógeno. Las barreras de defensa primarias de 'Okitsu' también protegen a la planta del ingreso de la cepa avirulenta X. aurantifolii tipo C, y por lo tanto, la resistencia se consigue
sin el requerimiento de la HR, que se desarrolla sólo si la bacteria ingresa al mesófilo
(Figura 4.I.5). Dado que las diferencias en comportamiento entre cultivares son máximas
cuando las hojas son inoculadas por aspersión en estadios tempranos (Figura 4.I.2 B), se propone que las barreras primarias superficiales se desarrollan más rápido en el cultivar 'Okitsu', en concordancia con el más rápido desarrollo fenológico a campo en este cultivar (Figura 4.I.1 B).
La cutícula es la primera barrera física de defensa de la superficie de las plantas que las protege de los patógenos. Está compuesta de cutina, un poliéster derivado de lípidos, y de ceras cuticulares (Beattie, 2002). Ha sido demostrado que el espesor y la composición de esta matriz hidrofóbica extracelular puede influenciar la colonización bacteriana de las hojas (Bessire et al., 2007; Marcell & Beattie, 2002; Whipps et al., 2008). Cutículas más cerosas y espesas interfieren con las poblaciones epifíticas bacterianas, inhibiendo el mojado foliar y limitando la solubilización y difusión de nutrientes desde la hoja (Lindow & Brandl, 2003; Whipps et al., 2008). La cutícula se desarrolla rápido durante el proceso de expansión de las hojas de los cítricos y los últimos estadios (i.e. dos tercios a expansión completa) coinciden con un rápido desarrollo de esta barrera protectora (Graham et al., 1992b). El desarrollo fenológico más acelerado de las hojas de 'Okitsu' durante el período de susceptibilidad a cancrosis a campo, podría estar asociado a un rápido espesamiento de la cutícula en este cultivar. Una cutícula más espesa podría impedir el ingreso a través de los estomas en 'Okitsu', debido a que en los cítricos la capa cuticular forma una cubierta alrededor de las células oclusivas, creando una antecámara sobre el poro estomático (Graham et al., 1992b).
Ha sido sugerido que el número y anatomía de los estomas podrían contribuir a la respuesta diferencial hallada entre un genotipo de kumquat resistente y un genotipo de naranja susceptible durante a la infección con X. citri (Wang et al., 2011). Sin embargo, Graham et al. (1992b) no pudieron asociar las diferencias en resistencia a cancrosis de siete especies diferentes de Citrus con el área de apertura y la densidad estomática.
Los resultados hasta aquí presentados en este trabajo de Tesis sugieren que factores específicos de la superficie de las hojas de 'Okitsu', tales como características de la cutícula, permeabilidad y/o densidad y apertura estomática, asociados todos con el estado fenológico de la hoja, estarían involucrados en la resistencia a la infección por Xanthomonas formadoras de cancro en cítricos.