La Resolución 3575 del 24 de diciembre de 1996 del DANCOOP queda derogada con este capítulo

Our  previous  studies  regarding  highly  stable  cytosolic  soluble  proteins  (16)  originating  from  thermostable  archaeal  organism  from  the  order  Sulfolobales  have  gave  an  insight  into  mechanisms  and  determinants  of  protein  thermostability,  but  also  some  additional  topics  for  discussion  from ecological and evolutionary points of view. We have discussed that  essential life preserving processes in the living cell are likelier to involve  more stable protein sequences in order to protect the life itself and that  exhaustive  thermal treatment of soluble cytosolic proteome has been a  good method of isolating highly stable proteome subset.  

These  results  were  in  agreement  with  data  from  literature  stating  that  per  se  presence  or  absence  of  certain  type  of  amino  acid  residues  or  group is not a sufficient prerequisite for difference in stability, bur rather  the  position  and  subsequent  interaction  of  the  residues  with  the  surrounding  ones  can  lead  towards  alteration  in  stability  properties.  SCOP  folds  are  also  not  very  strongly  biased  in  respect  to  the  thermostability. General observation regarding these results is that none  of  the  so‐called  predictive  thermostability  measures  in  fact  have  strong  predictive  capabilities  and  the  most  obvious  explanation  is  that  their  combination may or may not lead towards enhanced thermal stability. As  a  continuance  of  this  investigation,  further  study  provided  more  results  and developed conclusions based on isolation and identification of highly 

thermostable proteins originating from mesophilic bacterial organism E.  coli as the model system, using the same initial methodology, exhaustive  thermal  treatment  of  soluble  cytosolic  proteome  in  order  to  isolate  highly stable proteome subset.  

Sequences that were identified as highly stable after thermal treatment  (90oC)  of  E.  coli  cytosolic  proteome,  were  cross‐compared  with  the  results  published  by  the  group  of  Taguchi  and  co‐workers  regarding  bimodal solubility/aggregation distribution of E. coli proteome (18) of the  proteins expressed in cell‐free, chaperone‐free system named PURE. The  intersection  of  those  two  groups  of  sequences  ‐  superstable  cytosolic  proteins  that  survived  harsh  thermal  treatment  remaining  soluble,  and  chaperone‐free‐expressed soluble proteins, was investigated in order to  check  for  common  determinants  between  these  two  important  properties:  thermostability  and  solubility.  Interesting  conclusions  emerged, guiding towards the opinion that cellular guidelines that favor  protein thermostability are in common ones that favor solubility, or lack  of propensity to aggregate, of important life preserving sequences. 

5.3.

Objectives and Methodologies  

There  are  several  published  studies  regarding  correlation  of  protein  solubility and other sequence‐derived properties. Wilkinson and Harrison  (19) proposed a method that was latter improved for calculating protein  solubility  from  the  known  sequence,  that  is  based  on  parameters:  average charge, determined by the relative numbers of Asp, Glu, Lys and  Arg residues, and the content of turn‐forming residues (Asn, Gly, Pro and  Ser).  It  was  latter  demonstrated  that  insoluble  proteins  tended  to  have  more  hydrophobic  stretches  (longer  then  20  amino  acids),  lower  glutamine content (Q<4%), fewer negatively charged residues (DE<17%)  and higher percentage of aromatic amino acids (FYW>7.5%) than soluble  ones  (20),  allowing  prediction  of  protein  solubility  with  65%  accuracy.  Also,  high  content  of  negative  residues  (DE>18%)  and  absence  of  hydrophobic  patches  are  associated  with  improved  solubility  and  also  low percentage of aspartic acid, glutamic acid, asparagines and glutamine  residues  (DENQ<16%)  increases  the  probability  of  a  protein  to  be  insoluble. Analysis of more than 27 000 proteins from multiple organisms 

found  that  protein  solubility  is  influenced  by  (in  decreasing  order  of  importance):  percentage  of  serine  (S  <6.4%),  fraction  of  negatively  charged residues (DE <10.8%), percentage of S, C, T and M amino acids,  and length (<516 amino acids), in decreasing order of importance (21).  

  Fig.  5.1.  Schematic  illustration  of  the  PURE  expression  system  (18).  Each  ORF  in  the  ASKA  library,  which  has  all  of  the  E.  coli  ORFs,  was  amplified  by  PCR  using  two  common  primers  to  translate  the  gene  in  the  cell‐free  translation  system.  The  reconstituted  cell‐free  translation  system  (the  PURE  system)  contains no chaperones. After the 60‐min translation, an aliquot  of the translation mixture was centrifuged to obtain the soluble  fraction.  The  uncentrifuged  (Total)  and  supernatant  (Sup)  fractions  were  subjected  to  SDS/PAGE,  and  the  translated  products were quantified by autoradiography (18). 

In the continuance with the results presented in the previous chapter of  this thesis, this study further developed results and conclusions based on  isolation  and  identification  of  highly  thermostable  proteins  originating  from mesophilic bacterial organism E. coli as the model system. Process  of analysis started with exhaustive thermal treatment of soluble cytosolic  proteome  in  order  to  isolate  highly  stable  proteome  subset.  Soluble  cytosolic  extract  was  exposed  to  high  temperature  up  to  90o C  during  prolonged period of time, less stable denatured proteins were removed  by bench centrifugation,  while proteins that remained soluble  after this  treatment  were  subjected  to  further  analysis.  iTRAQ  protein  sequences  identification  and  quantification  of  this  “thermoproteome”  and  bioinformatics analysis gave an insight into possible relationship between 

thermostability  on  one  side  and  various  other  important  protein  properties.  Our  results  were  subsequently  compared  to  the  results  recently  published  in  literature  (18,  22,  23),  revealing  accordance  with  the  most  of  the  information  present  in  the  literature  up  to  date  in  following  manner:  Additional  point  of  discussion  was  comparing  our   data  regarding  the  E.  coli  cytosolic  proteome  subset  with  elevated  thermostability, with the information present in the literature regarding  the E. coli  cytosolic proteome subsets  with highly pronounced solubility  properties.   Taguchi and co‐workers (18) have previously published interesting set of  results that can relate with our findings in a mutually supporting manner.  They used a model named PURE, a reconstituted system (24) containing  only the essential E. coli factors responsible for protein synthesis (Fig 5.1,  (18)). Complete ASCA library ‐ consisting of all ORFs ‐ was translated, but  in the presence only of the essential E. coli factors responsible for protein  synthesis and excluding the presence of the chaperones. They performed  a  comprehensive  analysis,  successfully  quantified  more  than  3000  protein  sequences  of  the  initial  4000  ORFs.  The  fact  that  this  cell‐free  translation  system  contains  no  chaperones  enabled  to  investigate  and  evaluate  inherent  aggregation  propensities  (14,  17).  They  examined  propensity  for  protein  aggregation  by  a  centrifugation  assay  where  an  aliquot of the translation mixture was centrifuged and the solubility was  determined as the proportion of the supernatant fraction obtained after  the  centrifugation of the  translation mixture,  to the uncentrifuged total  protein.  They  have  also  invested  a  considerable  effort  in  identifying  residues stabilizing the native conformations of proteins. The aggregation  propensities of proteins, which were evaluated under the chaperone‐free  condition,  showed  that  the  proteins  were  categorized  into  two  groups,  soluble and aggregation‐prone. Another conclusion was that some of the  SCOP  folds  are  strongly  biased  to  the  aggregation  propensity  which  is  apparently  paradoxical  because  aggregates  formation  should  occur  before the completion of folding. We have cross‐compared our results of  the thermally (90oC) selected E. coli  cytosolic proteome subset with the  results  published  by  Taguchi’s  group  regarding  bimodal  solubility/aggregation  distribution  of  E.  coli  proteome(18)  publicly 

available  at  http://www.taguchi.bio.titech.ac.jp/eng/paper‐ e/assets/2009_PNAS_ecoli_proteins_solubility.xls .  

Our  subset  of  “superstable”  cytosolic  proteins  that  survived  harsh  thermal treatment and still remained in the solution, when compared to  the  published  ones,  obtained  results  available  in  this  segment  of  this  thesis.   

Publically  available  PubMed,  at  the  National  Center  for  Biotechnology  Information (NCBI) HUhttp://www.ncbi.nlm.nih.govUH  was used to access the 

bibliographic database. To check for easily detectable biases in our data  we  evaluated  the  classification  performance  of  simple  global  sequence  dependent protein features (isoelectric point, molecular weight, aliphatic  index  and  GRAVY  index)  by  retrieving  them  from  the  ProtParam  tool  of  the  ExPASy  proteomics  server  of  the  Swiss  Institute  of  Bioinformatics 

HU

http://us.expasy.org/tools/protparam.htmlUH.    Information  regarding  COG 

functional  categories  was  retrieved  from 

HU

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/old/xognitor.htmlU 

5.4.

Results and discussion 

In all of the presented results in this chapter, abbreviation “S” refers to  the  group  of  sequences  that  are  result  of  overlapping  data  from  our  thermally enhanced E. coli sequences with results from Taguchi and co‐ workers  (18).  The  intersection  of  those  two  groups  of  sequences:    a)  superstable  cytosolic  proteins  that  survived  harsh  thermal  treatment  remaining  soluble,  and  b)  chaperone‐free‐expressed  soluble  proteins,  was  investigated  in  order  to  check  for  common  determinants  between  these  two  important  properties:  thermostability  and  solubility.  Sequences “S” data are available in Appendix III. 

68B