Caracterización morfológica de los cuerpos de inclusión
Introducción
En general, los cuerpos de inclusión de otros granulovirus poseen anchos que van de 160 a 300 nm y largos de 300 a 500 nm (Tweeten et al., 1981). Los O B s de los G Vs contienen sólo un virión, el cual consiste en una nucleocápside envuelta por una membrana lipídica.
Microscopía electrónica
Como una primera aproximación a la forma del gránulo se obtuvieron imágenes de microscopía electrónica que permitieron determinar, de forma preliminar, la morfología y el tamaño de los cuerpos de inclusión y viriones de EpapGV. Los resultados de microscopía electrónica de transmisión de cortes ultrafinos de gránulos de EpapGV mostraron que los cuerpos de inclusión presentan una morfología elipsoidal cuyo tamaño promedio es de 469 (± 37) nm x 242 (± 22) nm. Si bien se ha calculado el tamaño promedio de los gránulos, es necesario resaltar la gran heterogeneidad de sus tamaños (Fig. 3.1). Cortados en diferentes secciones, los gránulos poseen como característica común la presencia de un sólo virión, el cual posee una forma cilindrica, presentando en algunos casos una leve curvatura. El tamaño de los viriones se determinó en 259 (± 9) nm x 22 (± 3) nm. Los viriones se presentan rodeados por una estructura que se identificaría con una membrana lipídica clásica de las nucleocápsides envueltas (Fig. 3.2).
Figura 3.1. Microscopía electrónica de cortes ultrafinos del virus de
la granulosis de
EpapGV (la barra
representa 1 nm).
Algunos gránulos aparentan tener un espacio vacío en lugar del virión, que se debería a un artefacto provocado por la cuchilla utilizada al cortar el material incluido en la resina. Los datos obtenidos por el autor de esta tesis deben ser tomados como una aproximación inicial debido a la no disponibilidad de microfotografias electrónicas con mayores aumentos.
Con posterioridad y empleando aumentos mucho mayores, Alicia Cap y Alina Goldberg llevaron a cabo un trabajo minucioso analizando cortes de tejidos de E.
aporema infectados con EpapGV y obtuvieron datos más ajustados que fueron publicados (Sciocco-Cap et al., 2001). En esa publicación, se precisaron las
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dimensiones del cuerpo de inclusión [466 (± 8.9) nm de largo por 296 (± 6.0) nm de ancho], de los viriones [290 (± 10,9) nm de largo x 61,2 (± 1,8) nm de ancho] y de la nucleocápside en 226 (± 8,9) nm x 41,7 (±4,1) nm. Por otra parte, estos tamaños se correlacionan con los descriptos en bibliografía para los GVs (Tweeten et al., 1981).
Determinación de la cantidad de proteínas en el cuerpo de inclusión de EpapG V
Para obtener la cantidad de granulina que se encuentra, en promedio, en un cuerpo de inclusión de EpapGV se ha recurrido a consideraciones geométricas y a los valores de densidad de flotación de grànulo.
Los cuerpos de inclusión de EpapGV poseen una estructura similar a un elipsoide. El elipsoide es la figura geométrica que se forma al girar una elipse sobre uno de sus ejes. El volumen de esta figura es igual a 4/3 n a.b.c, siendo a, b y c los radios de cada uno de los ejes. De acuerdo con las estimaciones del tamaño del OB de EpapGV, largo: 466 (± 8,9) nm y ancho 296 (±6,0) mm (Siocco-Cap et al., 2001), se calculó el volumen de un grànulo de EpapGV, el cual sería equivalente a 2,14 x 14 cm3. A partir de este valor y de la densidad de flotación del cuerpo de inclusión se calculó la masa de un grànulo. Específicamente, los gránulos se purificaron de un gradiente de sacarosa, extrayéndose los mismos de la banda correspondiente a una densidad de 1,24 g/cm3. De acuerdo con la fórmula 6 = m/v, la masa de un grànulo es de 2,65x10-14 g ó 2,65 x 10'8 |iig. De esta masa, el 95% corresponde a granulina (Bergold, 1964) lo que implica que cada grànulo tiene 2,52 x 10-8 pg de granulina. Además, de estos datos se obtiene que 1 jug de proteina total equivale a 3,77 x 107 OB y 1 pg de granulina equivale a 3,97 x 107 OB.
Figura 3.2. Microscopía electrónica de cortes ultrafinos del virus de
la granulosis de
Epinotia aporema. (La barra representa 500 nm).
Por otra parte, si tenemos en cuenta que el peso molecular de la granulina es de 29,1 kDa (conforme a su secuencia aminoacídica completa) el peso de una molécula de granulina es 4,83 x 10 20 g. Según estos datos, cada grànulo contiene alrededor de 5,2 x 105 moléculas de granulina.
Análisis de la proteina mayoritaria de E p a p G V
Purificación de gránulos de EpapGV
Métodos de purificación
Los gránulos de EpapG V fueron purificados por diversos métodos según su uso posterior: (A), a partir de gradiente de sacarosa; (B), en gran escala mediante centrifugaciones diferenciales y (C ), por medio de centrifugaciones diferenciales de pequeñas cantidades de gránulos (minipreparación o minipurificación) (Fig. 3.3).
El primer método está basado en la separación de gránulos en base al coeficiente de sedimentación en gradiente. Este método permite separar bacterias contaminantes y obtener preparaciones de OBs de alta pureza. Si los O Bs se purifican sin emplear
buffers con SD S, los cuerpos de inclusión pueden ser utilizados para ensayos de
tiempo letal 50 ( T L50) y dosis letal 50 ( D L50) . El empleo de detergentes iónicos aparentemente elimina moléculas necesarias para la infección irt vivo. El segundo y tercer método están basados en centrifugaciones diferenciales de grandes y pequeñas cantidades de homogeneizados de larvas infectadas. Estas centrifugaciones precipitan diferencialmente a los contaminantes (restos de tejidos, quitina, bacterias). En el caso del protocolo B, en lugar del gradiente se emplearon centrifugaciones diferenciales. La solución de NaCI 0,5 M empleada en B y C, se empleó para despegar interacciones iónicas entre proteínas contaminantes y el OB. Esta solución, contribuiría además para limpiar la pared de lipopolisacáridos (LPS) de posibles bacterias contaminantes, haciendo las mismas más sensibles a cambios en la presión osmótica.
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Figura 3.3. Métodos de purificación de gránulos de EpapGV. Nota: El método B ha sido puesto a punto por otro de los miembros del grupo de trabajo.
Control del proceso de purificación de gránulos de EpapGV
Los ensayos de S D S -P A G E han mostrado eficacia para establecer criterios de pureza e integridad de las preparaciones de polipéptidos. En igual sentido, es posible emplear la microscopía óptica para el seguimiento de la purificación, en particular para detectar la presencia de restos de tejidos de insecto y de bacterias en la preparación (Maruniak, 1986).
Si bien se emplearon protocolos de purificación convencionales, se consideró apropiado contar con evidencias experimentales que aseguraran la validez de los mismos para EpapGV. Se controlaron las siguientes variables: A, velocidades y tiempos de centrifugación; B, actividad proteasa alcalina y C, inactivación de la proteasa alcalina por tratamiento térmico.
Control de las velocidades y tiempos de centrifugación de la m inipurificación
Para la puesta a punto de la minipurificación, se buscó el menor tiempo de centrifugación que precipitara la mayoría de los cuerpos de inclusión de un homogeneizado de larvas infectadas con EpapGV. Como control, se centrifugaron nuevamente los distintos sobrenadantes (SN) verificando que sus sedimentos no contuvieran una cantidad significativa de gránulos. En particular, se analizaron por SDS-PAGE alícuotas equivalentes de homogeneizado de larvas infectadas y no infectadas, así como sobrenadantes y precipitados de centrifugación. Como criterio de detección de la presencia de los gránulos de EpapGV se siguió la aparición de la proteína viral mayoritaria (granulina) de aproximadamente 30 kDa en SDS-PAGE (Fig. 3.4, calle 9).
Figura 3.4. SDS-PAGE 15% de homogeneizados de larvas sanas e infectadas con EpapGV. Calle 1 y 2, Albúmina Sérica Bovina, (B S A ); calle 3, marcador de peso molecular (M PM ) "Sigm a Gel Low Range"; calle 4, homogeneizado total de larvas no infectadas; calle 5, homogeneizado total de larvas infectadas; calle 6, sobrenadante del homogeneizado de larvas no infectadas; calle 7, sobrenadante del homogeneizado de larvas infectadas; calle 8, sedimento de homogeneizado de lanzas no infectadas; calle 9, sedimento de homogeneizado de lanzas infectadas; calle 10, control positivo: gránulos de EpapG V purificados por centrifugación en gradiente de sacarosa. A la izquierda se aprecian los tamaños del MPM "Sigma Gel Low Range" y a la derecha se ha señalado con una flecha, la banda de granulina.
En este gel, en la calle 5 puede apreciarse la gran proporción de esta proteína sobre las proteínas totales del homogeneizado y la presencia casi exclusiva de proteínas virales en el precipitado de centrifugación (Fig. 3.4, calle 9). Las diferencias en la
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tinción entre la banda de granulina de la calle 5 y la calle 9, se deberían a la compresión de la banda de granulina en esta última calle. Se observó también la ausencia de granulina tanto en el homogeneizado de larvas (Fig. 3.4, calle 4), como en el sobrenadante de centrifugación del homogeneizado de larvas no infectadas (Fig. 3.4, calle 6) y en el sedimento de la misma muestra (Fig. 3.4, calle 8). Los resultados de figura 3.4, indicaron que las velocidades y tiempos de centrifugación (3 min. a 14- 18.000 x g en microcentrífuga) del protocolo C, fueron efectivos para precipitar la totalidad de los gránulos presentes en un homogeneizado de larvas infectadas.
Determinación de la presencia de actividad proteasa alcalina
Se evaluó la disolución de cuerpos de inclusión de EpapGV con el objeto de verificar la presencia de actividad proteasa alcalina en los OBs y para controlar si el tiempo de disolución del gránulo en medio básico era apropiado. Para ello, se trataron distintas preparaciones de gránulos con solución alcalina. A distintos tiempos de tratamiento (1, 15 y 30 minutos) la suspensión fue neutralizada con HCI 0,1 N y centrifugada durante 3 min. a 14-18.000 x g en microcentrífuga. Tanto el sobrenadante como el sedimento fueron calentados 5 min. con buffer de muestra y se resolvieron en SDS-PAGE (Fig. 3.5).
En la figura 3.5 puede observarse los OB de EpapGV son solubilizados y/o degradados rápidamente al ser tratados con solución alcalina, dado que a un minuto post tratamiento la cantidad de granulina en el sedimento de centrifugación era varias veces menor que la original. Además se observó una banda de 25 kDa producto de la
Figura 3.5. SDS-PAGE 15% con muestras de gránulos tratados con solución alcalina. Se trataron OBs de EpapGV con solución alcalina y a distintos tiempos de tratamiento (1, 15 y 30 minutos) la suspensión fue neutralizada con HCI 0,1 N y centrifugada durante 3 min. a 14-18.000 x g en microcentrífuga. Tanto el sobrenadante como el sedimento fueron calentados 5 min. con buffer de muestra y resueltos en geles de S D S - PAGE. Calle 1, MPM "Sigma Gel Low Range calle 2, gránulos de EpapGV sin tratar (N T). Sobrenadantes después de 1, 15 y 30 minutos: 1S, 15S, 30S en calles 3, 5 y 7. Sedimentos (“pellets”) después de 1, 15 y 30 minutos: 1P, 15P, 30P en calles 4, 6 y 8. Calle 9, BSA. A la izquierda se aprecian los tamaños del MPM. Con flechas se indican la posición de granulina y del producto de degradación mayoritario de 25 kDa.
degradación de granulina por la proteasa alcalina. La cantidad de este producto de degradación se incrementó en los sedimentos ("pelletsH) correspondientes a 15 y 30 minutos de tratamiento con solución alcalina. La banda de degradación de 25 kDa se detectó, mayoritariamente, en el sedimento de gránulos y una pequeña porción de la misma se localizó en los sobrenadantes, sugiriendo que esta proteína permanecía asociada al OB. La presencia de bandas asociadas a la degradación de proteínas mayoritarias está de acuerdo con lo descñpto por Yamafuji et al. (1958). Este tratamiento en medio alcalino provoca la desorganización de los OBs liberando las ENCs. Con respecto a la granulina (30 kDa), esta proteína fue detectada casi exclusivamente en los sedimentos de centrifugación y su nivel fue decreciendo con a medida que se incrementó el tiempo de tratamiento.
En conclusión, en las condiciones experimentales ensayadas la proteólisis de la mayor parte de la granulina de los OBs se produjo antes de los 30 minutos de tratamiento con medio alcalino.
Inactivación de la proteasa alcalina
Para usos posteriores, era necesario disolver los gránulos sin degradar las proteínas virales de la matriz de oclusión y del virión. Por esto, se decidió verificar un protocolo de inactivación de la proteasa alcalina por calentamiento a 75 °C durante 45 a 60 min. (Summers & Smith, 1975). Posteriormente, los OBs se incubaron en solución alcalina, y al cabo 30 minutos se neutralizaron las muestras con HCI 0,1 N y se sembraron alícuotas equivalentes en gel de poliacrilamida.
Figura 3.6. Control de inactivación de la actividad proteasa alcalina en SDS-PAGE 12%. Calle 1, gránulos de E p a p G V sin tratamiento inactivante y sin tratamiento alcalino; calle 2, gránulos de E p a p G V no inactivados y con tratamiento alcalino; calle 3, gránulos de E p a p G V ¡nactivados por calor y tratados con carbonato. A la izquierda se aprecian los tamaños del M P M “Bio Rad Broad R ange”.
Nota: en este gel a la altura de 45 kDa se encuentra una banda de proteína contam inante.
Los resultados indicaron que los OBs de EpapGV tratados con calor e incubados en
buffer alcalino no sufrieron proteólisis (Fig. 3.6, calle 3), por el contrario el lote no tratado con calor (Fig. 3.6, calle 2) mostró un producto característico de degradación de 25 kDa. Las diferencias en la cantidad de granulina degradada en función del
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control no tratado entre este experimento y el de la figura 3.5, podrían deberse a que las muestras provienen de dos preparaciones diferentes de gránulos.
Conclusiones parciales respecto a protocolos de purificación
El análisis de los resultados de los experimentos de control de las variables de purificación, indicó que los protocolos empleados poseen las características deseadas para la correcta purificación de gránulos de EpapGV. En particular, el tiempo óptimo de disolución de gránulos fue menor a 30 min. Además, el tratamiento por calentamiento a 75 °C durante 45 min. inactivó satisfactoriamente la actividad proteasa alcalina.
Identificación de proteínas estructurales
Perfil de proteínas del cuerpo de inclusión por análisis de SDS-PAGE
A fin de caracterizar de manera preliminar las proteínas totales de cuerpo de inclusión de EpapG V se realizó una electroforesis en condiciones desnaturalizantes en gel.de poliacrilamida con muestras de gránulos de EpapGV (Fig. 3.7). En este gel se resolvieron en paralelo OBs de EpapGV y de Cydia pomonella G V (C p G V ). Ambas muestras presentaron perfiles similares y proteínas mayoritarias de alrededor de 30 kDa. El peso de estas proteínas mayoritarias está en el rango descripto para las proteínas de inclusión dé ÑPVs y G V s entre 25,2 kDa y 31,4 kDa (Summers & Smith, 1978). De acuerdo con el peso molecular y con el nivel de expresión, está proteína sería la granulina de EpapGV.
Además, en EpapG V se observan otras proteínas minoritarias cuyos pesos moleculares son similares a las proteínas de C p G V (64,7 kDa; 59,9 kDa; 24,9 kDa y 19,4 kDa). Con respecto a las bandas de 64,7 kDa y de 59,9 kDa, las mismas podrían ser dímeros de granulina. Summers & Smith (1978) encontraron que al someter a S D S -P A G E a granulina purificada, aparecían bandas del doble de peso molecular de esta proteína (60-66 kDa). Posteriormente, otros autores informaron que si se extraían estas bandas y se las trataba con agentes reductores y la muestra era sometida a una electroforesis de S D S -P A G E , encontraban una proteína de 30 kDa que reacciona con
antisueros anti-granulina/poliedrina. Datos no mostrados aquí, indicaron que
la banda de granulina y con estas dos bandas (64,7 kDa y 59,9 kDa) apoyando las hipótesis del dímero de granulina.
Figura 3.7. Gel de poliacrilamida 12% con OBs de EpapGV y CpGV. A am bo s lados de la figura se muestran los perfiles de proteínas de los gránulos purificados de E p a p G V y C p G V (gel de poliacrilamida teñido con Coomassie blue). En la parte central se indican los pesos de las proteínas mayoritarias. Sólo se indican las proteínas m ás representativas. E n este gel, la banda de 45 kD a de C p G V se encuentra poco teñida.
Determinación aproximada del peso m olecular de la proteína mayoritaria de EpapG V
Con el objeto de conocer de forma más precisa el peso molecular de la proteína mayoritaria de EpapGV, se diluyó convenientemente una preparación de gránulos y la misma se resolvió en SDS-PAGE (Fig. 3.8). En paralelo, se resolvieron muestras de cuerpos de inclusión de otros NPVs y GVs.
Figura 3.8. Perfil de proteínas de GVs y NPVs en SDS-PAGE
12%. Calle 1 y 9
m arcadores de PM , “Bio Rad Broad R a n g e ”; calle 2, larvas de E p a p G V no infectadas; calles 3-7, gránulos de G V s y N P V s : calle 3, E p a p G V ; calle 4, C p G V ; calle 5, A g M N P V ; calle 6, S fM N P V ; calle 7, R o u S N P V ; calle 8, B S A . A la izquierda se aprecian los tam años del M P M “Bio Rad Broad R a n g e ”.
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Exceptuando CpGV, las muestras correspondieron a virus cuyos insectos blanco atacan a cultivos de soja. El peso molecular aparente de la granulina de EpapGV, extrapolado de los marcadores de peso molecular, resultó en 28,5 ± 0,5 kDa y coincide con el rango de 25,2 a 31,4 kDa informado por Summers & Smith (1978) para estas proteínas de inclusión.
Secuenciamiento parcial de la proteina mayoritaria del cuerpo de inclusión
Secuencia am ino terminal
A partir del análisis de perfiles de SDS-PAGE de gránulos de EpapGV y en base al nivel de expresión y el peso molecular de la proteína mayoritaria, es posible asumir que la misma corresponde a granulina. Para verificar esto último, se secuenció el extremo amino-terminal de la banda de gel de poliacrilamida. Con ese objeto, se calentaron en buffer de muestra gránulos purificados de EpapGV y se resolvieron por electroforesis de geles preparativos de Tricina-SDS-PAGE (Fig. 3.9) (Schágger & Von Jagow,1987).
F ig u r a 3 .9 . G e l p r e p a ra t iv o d e g r á n u lo s d e E p a p G V . Calle 1,
marcador de peso molecular
“Sigma Gel Low Range”; calle 2 y 3
(calle central preparativa),
proteínas de gránulos de EpapGV; calle 4, Albúmina Sérica Bovina (B S A ).'A la izquierda se aprecian los tamaños del MPM y a la derecha se ha señalado con una flecha la banda de granulina de EpapGV.
Las proteínas fueron transferidas a una membrana de PVDF (polivinil-difluoruro) durante 120 min. a 0,25 A. La banda de la proteína mayoritaria se ubicó por tinción de los laterales de la membrana con solución 1% Rojo Ponceau, y se extrajo la sección correspondiente a la banda de la proteína de interés por corte de la membrana (aproximadamente 20 pg ó 670 pmoles). La secuencia amino terminal se determinó por el método de Edman modificado (Matsudaria, 1987) hasta el aminoácido número 15. Pese a que en las condiciones de trabajo no fue posible descartar que la banda de
granulina no estuviera superpuesta con otra de igual tamaño, el alto nivel de expresión de la granulina habría contribuido para que el ruido de fondo en la determinación de la secuencia proteica no fuese significativo. La secuencia de la granulina de EpapG V correspondió a G Y N K S L R Y S R H E G T T .
Comparación de ia secuencia amino terminal
Cuando se comparó la secuencia amino terminal de la proteina mayoritaria de EpapGV con sus homologas, ésta mostró un alto grado de similitud (80-100% ) con respecto a las secuencias de los extremos amino terminales de otras granulinas (Tabla 3.1). Este dato, confirmó de la identidad de la proteina de inclusión y apoyó la asignación del virus aislado de larvas de E aporema al género Granulovirus.
Tabla 3.1. Secuencias am ino terminales de granulinas.
B aculovirus * Secuencia am inoacídica D Determinación Núm ero de acceso
E p a p G V -GYNKSLRYSRHEGTT s e c . peptídica - E p a p G V MGYNKSLRY SRHEGTT D N A A F 4 7 3 7 0 3 E e G V MGYNKSLRY SRHEGTT D N A - A o G V MGYNKSLRY SRHEGTT D N A A A L 0 2 0 8 2 P h o p G V MGYNKTLRY SRHDGTT D N A - C p G V MGYNKSLRY SRHDGTS D N A A A K 7 0 6 6 8 C IG V MGYNKSLRY SRHDGTT D N A C A A 5 6 1 0 7 C f G V MGYNKALRY SRHDGTS D N A A A C 6 9 5 4 4 H b G V MGYNKSLRY SRHEGTT D N A A A F 6 6 6 1 0 S p H G V MGYNRSLRY SRHNGTT D N A - P x G V MGYNKSLRY SRHDGST D N A A A G 2 7 3 0 2 T n G V MGYNKSLRY SRHNGTT D N A A A A 4 3 8 3 4 X c G V MGYNKSLRY SRHNGTT D N A A A B 4 2 0 5 9
A s G V -GYNKSLRY SRHAGTS s e c . peptídica P 3 1 0 3 5
L o G V MGYNKSLRY SRHDGTT D N A - P b G V MGYNRALRY SKHEGTT D N A P 0 6 5 0 2 C o n s e n s o d e granulinas MGYNKSLRY SRH.GTT D N A -• C o n s e n s o d e poliedrínas G l c G il MYTRYS— YNPSLGRTYVY MPDYS - - YRPTIGRTYVY D N A
a Adoxophyes orana GV (ÁoGV), Agrotis segetum GV (AsGV), Choristoneura fumiferana GV (CfGV),
Cydia pom onella GV (CpGV), Cryptophlebia leucotreta GV (CIGV), Harrisina bríllians GV (HbGV), Pieris brassicae GV (PbGV), Plutella xylostella GV (PxGV), Tríchoplusia ni GV (TnGV), Xestia c-nigrum GV
(XcGV). Las secuencias de granulina de PhopGV y SpIiGV fueron gentilmente provistas por el Dr. López-Ferber, el Dr. lan Smith nos aportó la secuencia de la granulina de Lacanobia olerácea GV (LoGV). Las secuencias de Tríchoplusia n i 2 (Tni2) y Erínnyis ello (EeGV) han sido informadas (Ghiringhelli et al., 1996) pero no publicadas aún en GenBank.
b Las diferencias con la secuencia consenso se indican en negrita. El consenso resultó de la aplicación de la regla de la mayoría, por ejemplo: el residuo más abundante en cada posición fue tomado como el aminoácido consenso.
c Gl: NPVs grupo I, Gil: NPVs grupo II.
Con posterioridad a la determinación de esta secuencia aminoacídica, otras tres secuencias de granulinas publicadas (Adoxophyes orana GV, A oG V ; Harrisina bríllians G V , H b G V y Erínnyis ello, EeG V) resultaron idénticas para 14 aminoácidos N- terminales (exceptuando la metionina terminal). Cuando la secuencia completa del gen
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de granulina de EpapGV estuvo disponible a partir de la información del DNA clonado