Aislamiento e Identificación del Agente Causal del Tizón Común del Frijol Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
Utilizando la técnica de maceración de tejido de hojas de frijol con síntomas de tizón y sembrado una asada del liquido de extracción en medio KB por estría cruzada (Fig. 7), nos permitió recuperar y caracterizar, fisiológica y bioquímicamente a un aislado bacteriano obtenido como Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, reportado
como el agente causal del tizón foliar del frijol (Rodríguez, 2001).
Figura 7. Colonias bacterianas característica de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
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La prueba de tinción diferencial indico que es una bacteria Gram negativa (Fig. 8.a), que produce la formación de un halo mucoide a la presencia de KOH, considerándose la prueba positiva a la reacción de Ryu (Fig. 8.b), es catalasa positiva al inducir el desdoblamiento del H2O2, (Fig. 8.c), y positiva a la producción de oxidasa (Fig. 8.d). La bacteria obtenida fue anaeróbica facultativa y prueba de oxidasa positiva (Fig. 8.e). La prueba de crecimiento a 35°C dio resultado positivo (Fig. 8.f), así como también al crecimiento en YDC (Fig. 8.g).
Figura 8. Pruebas Fisiológicas para la identificación de Xanthomonas axonopodis, a)
Tinción de Gram, b) Reacción de Ryu, c) Prueba de Catalasa, d) Producción de Oxidasa, e) Oxidación y/o Fermentación, f) Crecimiento a 35°C y g) Crecimiento en YDC.
a
b
c
d
e
f
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El aislamiento bacteriano obtenido dio resultado positivo a la producción de levana en agar nutritivo suplementado con sacarosa, donde creció de manera abundante (Fig. 9.a), también alcalinizo la leche litmus (Fig. 9.b) e hidrolizó el almidón en medio solido (Fig. 9.c) y en medio SX (Fig. 9.d), también da una abundante producción de de H2S (Fig. 9.e) en medio rico en peptona, detectado en tiras de papel filtro impregnado con acetato de plomo considerando el resultado como una prueba positiva al ennegrecimiento de la tira, que es característico de este género de bacteria fitopatógena. Otra prueba diferencial fue la de esculina (Fig. 9.f), que se detecto indirectamente por la presencia de fluorescencia en el cultivo la cual dio positivo al aislado de Xanthomonas axonopodis (Tabla 4).
Fig. 9. Pruebas Bioquímicas para la identificación de Xanthomonas axonopodis, a)
Producción de Levana, b) Leche Litmus, c) Hidrólisis de Almidón medio Agar, d) Hidrólisis de Almidón medio SX, e) H2S de Peptona, f) Hidrolisis de Esculina.
a)
b)
c)
d)
e)
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La producción de ácidos a partir de carbohidratos se evaluó mediante el cambio del indicador de pH, en el caso de arabinosa (Fig. 10.a) fue purpura de bromótimol, y en los demás azucares se empleo azul de bromótimol, como se muestran en las figuras (10.b – 10.f), también fue importante observar que en el testigo en todo los tubos de ensayo permaneció sin cambio en el color del indicador.
Figura 10. Asimilación y Acidificación de Carbohidratos para Xanthomonas
axonopodis. Producción de ácidos a) Arabinosa, b) Manosa, c) Galactosa,
d) Celobiosa, e) Fructosa, y f) Trehalosa
d)
e)
f)
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Tabla 4. Características, fisiológicas y bioquímicas descritas para Xanthomonas axonopodis y el aislado del tizón común del frijol.
PRUEBAS Xanthomonas axonopodis* Xanthomonas axonopodis pv. Phaseoli** Tinción de Gram - - Reacción de Ryu + + Prueba de la Catalasa + + Producción de Oxidasa + +
Metabolismo Oxidativo y/o Fermentativo +/- +/- Producción de Levana + + Crec. a 35 °C + + Crec. en YDC + + Hidrólisis de esculina + +
Hidrólisis de Almidón medio Agar + +
Hidrólisis de Almidón medio SX + +
Leche Litmus - - H2S de peptona + + Producción de ácidosb Arabinosa + + Manosa + + Galactosa + + Celobiosa + + Fructosa + + Trehalosa + +
a = En medio agar nutritivo +5.0% de sacarosa.
b = Dentro de los 21 días según el método de Dye (1962).
* Especie Xanthomonas axonopodis descrita por Shaad et al., (2001).
34 Evaluación de los extractos Inductores de Resistencia
Incidencia del tizón bacteriano del Cultivo del Frijol
La presencia de la enfermedad se observo en todas las plantas bajo estudio, por lo que se consideró que la incidencia fue del 100 % en todos los tratamientos. Los síntomas observados fueron manchas en las puntas de las hojas de color café- amarillo de manera homogénea en todas las plantas del experimento (Fig. 11).
35 Severidad del Tizón Bacteriano del Cultivo del Frijol
La severidad se determino mediante un porcentaje del área foliar dañada. Los datos obtenidos en las cuatro evaluaciones se muestran en la (Tabla 5).
Tabla 5. Severidad en porcentaje de daño (%) de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli en plantas de frijol en cultivo bajo invernadero.
Tratamientos. Comparativo 09/03/11 1era Lectura y 2da Aplicación 16/03/11 2da Lectura y 3era Aplicación 23/03/11 3era Lectura y 4ta Aplicación 30/06/11 Bacillus 17.1 A 19.2 A 17.7 B 15 BC Bac+Jas+Sal 18.3 A 24.8 A 24 AB 21 B Cuprimicina 20.8 A 17.5 A 15.1 B 11.6 C Ac. Jasmónico 21.6 A 18 A 15.4 B 11.4 C Ac. Salicílico 20.8 A 21.3 A 19.6 B 14.8 BC Testigo 19.6 A 28 A 29.6 A 47 A
En la primer columna de la (Tabla 5) se muestra que la severidad de la enfermedad a los 30 días de la siembra es estadísticamente similar con todos los tratamientos, lo que era de esperarse ya que la semilla fue previamente detectada con la presencia de X. axonopodis y corrobora la presencia de la enfermedad antes
de la aplicación de los tratamientos.
En la segunda columna de la 1era lectura y 2da aplicación (Tabla 5), a los 8 días de
haber aplicado los tratamientos por primera vez, se observa la severidad del tizón bacteriano estadísticamente no es significativo (P=0.05).
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La severidad obtenida en la 2da lectura y 3da aplicación (Tabla 5), muestra una
diferencia significativa entre los tratamientos. La severidad vario del 15.1 % con la Oxitetraciclina al 29.6 % en el Testigo. Sin embargo la severidad observada en los tratamientos con los extractos de Ácido Jasmónico obtenido de Botryodiplodia theobromae y de Ácido Salicílico obtenido de Pseudomonas fluorescens y la
aplicación de esporas de Bacillus sp. (15.4, 19.6 y 17.7 %) respectivamente es
estadísticamente similar a la obtenida en el tratamiento con Oxitetraciclina (15.1 %). Esto demuestra que los extractos de Botryodiplodia theobromae y Pseudomonas fluorescens reducen el nivel de daño causado por la enfermedad. Este hecho no se
observo en la combinación de la suspensión de esporas de Bacillus y extractos de
fermentación ya que no hubo sinergismo en su efecto protector en la planta, que presenta un porcentaje de severidad inferior al Testigo donde no se aplica producto, por lo que la mezcla resulto antagónica.
Los resultados de severidad obtenidos en la última evaluación se muestran en la cuarta columna, 3era lectura y 4ta aplicación (Tabla 5). Los datos obtenidos indican que
hay diferencia significativa entre los tratamientos. Es importante señalar que todos los tratamientos presentan una severidad estadísticamente inferior a la observada en el Testigo absoluto; también se encontró que el índice de severidad más bajo fue el obtenido con Ác. Jasmónico, Oxitetraciclina y Ác. Salicílico (11.4, 11.6 y 14.8) respectivamente, además de que no existe diferencia estadística entre ellos, mientras que en el Testigo se alcanzó una severidad del 47 % en daño. Así, el mejor resultado se obtuvo con el extracto de Ác. Jasmónico obtenido de la fermentación de
Botryodiplodia theobromae, reduciendo un 75 % el nivel de daño del tizón foliar en
relación al Testigo absoluto. Se observo que los tratamientos a base de Bacillus y
Ác. Salicílico muestran un efecto de control de la enfermedad al reducir significativamente la severidad del tizón común del frijol; mientras que la combinación de Bacillus y extractos de fermentación no muestran un buen efecto en la
disminución del índice de severidad; al parecer no hay una acción sinérgica si no antagónica ya que no logro disminuir la severidad a lo largo del establecimiento del
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ensayo, si no que se mantiene estable durante el experimento, aunque es inferior estadísticamente al Testigo absoluto en la última evaluación.
Al final de esta investigación se pudo comprobar que la aplicación de mezcla de esporas del genero Bacillus sp. (1x10-9 esporas/mL), extracto de fermentación de B. theobromae conteniendo Ácido Jasmónico y extracto de fermentación de Ps. fluorescens conteniendo Ácido Salicílico así como la combinación de estos
mantienen y reducen significativamente la severidad del tizón común del frijol en comparación al testigo comercial y a el testigo absoluto sin aplicación.
Al igual que en otras investigaciones se encontró que el efecto de inducción de resistencia medida de forma indirecta hacia el tizón bacteriano de los extractos conteniendo ácido jasmónico y ácido salicílico, se encuentran ya reportados como inductores generales de resistencia, y fueron descritos a partir de la década de los ochenta, donde se demostró efectos tales como: incremento de rendimientos agrícolas en fresa, soya y caña de azúcar (Koda et al., 1991), y un papel especial en
los mecanismos de defensa de las plantas (Kitahara et al., 1991). Se conoce que la
activación de genes en las plantas debido al ataque de patógenos o por heridas mecánicas provoca la síntesis de sustancias de defensa como el inhibidor de proteasas en las zonas dañadas (Cohen et al., 1993) y (Xu D. et al., 1993), lo cual
pudiera explicar el hecho de encontrar menor daño en la planta de frijol en los tratamientos aplicados, razón por la cual la severidad fue menor respecto del testigo donde no se aplicaron los extractos.
CONCLUSIÓN
El agente causal del tizón común en el cultivo del frijol fue la bacteria
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli; confirmado por características morfológicas,
fisiológicas y bioquímicas.
La aplicación de Ácido Jasmónico como extracto de fermentación de
Botryodiplodia theobromae a plantas de frijol con presencia de tizón bacteriano
permite reducir la severidad de la enfermedad hasta en un 75 % en el cultivo.
La aplicación de Ácido Salicílico como extracto de Pseudomonas fluorescens y Bacillus sp. (1x10-9 esporas/mL),demostró un efecto de control de la enfermedad.
La combinación de Bacillus sp. (1x10-9 esporas/mL) + Ácido Jasmónico +
Ácido Salicílico como mezcla sinérgica mantiene la severidad y presencia del tizón sin presentar un incremento de acción conjunta en la reducción del daño en la planta de frijol.