5. Obtenció de la proteïna recombinant VP2 en el sistema baculovirus-Sf9
5.7. Resum dels resultats de producció obtinguts
Una vegada finalitzada la definició de les estratègies de cultiu i del sistema de monitoratge per a realitzar la proposta d’automatització del procés, es recapitula i es resumeixen els resultats obtinguts amb cadascuna de les estratègies estudiades, des del punt de vista productiu. A la Taula 5-4 es recullen els resultats més rellevants que permetran realitzar una anàlisi comparatiu inicial que permeti escollir el procés a estudiar amb detall en el darrer capítol del present treball. Degut a que les anàlisis econòmiques de processos biotecnològics que utilitzen línies cèl·lules d’animals assignen el 50% del cost productiu al medi de cultiu, es normalitza el valor de concentració de VP2 respecte el medi de cultiu total emprat en cadascuna de les estratègies. Aquest valor és el criteri per a realitzar la tria del bioprocés basat en el sistema baculovirus-Sf9 per a la producció del candidat vacunal.
Estratègia [VP2] μg/mL Volum medi infectat (L) Volum total medi emprat (L) [VP2]cμg/mL
emprat MOI =1,5 22 2 2 22 Discontinu MOI = 0,05 43 2 2 43 1 operació 108,6 2 9,58 22,67 2 operació 108,6 4 15,39 28,23 2 etapes discontinu 3 operació 108,6 6 21,2 30,73 94 h 38 4,7 23,02 7,75 ζ =40 h 300 h 38 15 52,48 10,86 120 h 45 4 25,64 7,02 2 etapes continu ζ =60 h 300 h 45 10 49,72 9,05
Taula 5-4: Taula resum dels resultats de producció de la vacuna recombinant VP2 emprant el sistema d’expressió la interacció baculovirus-cèl·lula d’insecte. Per cadascuna de les estratègies es mostra el resultat de concentració de VP2 assolida, així com la correcció segons la quantitat de medi necessari per a cadascun dels bioprocessos emprats (darrera columna, [VP2]c).
Com es pot observar a la taula, tot i que a priori hom pot pensar que el sistema de dues etapes, primera etapa en perfusió i segona en discontinu, ofereix la concentració de producte més elevada (108,6 μg/mL), i per tant és la més rendible, un anàlisi més detallat normalitzant el valor de la concentració en funció de la quantitat de medi necessari per a la producció, fa arribar a conclusions diferents. El valor de la relació de producte en funció del medi necessari que s’obté finalment és de 22,67 μg/mL. Aquest valor augmenta progressivament fins a 30,73 μg/mL si es dissenya un procés en el qual es van enllaçant diferents etapes d’infecció a partir d’un mateix bioreactor que exerceix la funció de producció de cèl·lules. No obstant, aquest sistemes necessiten de tres bioreactors mínim (un en funcions de producció de cèl·lules, i dos per a realitzar les infeccions), disseny que comportarà un augment de cost de la planta i de cost de producció.
Per altra banda la taula mostra com els processos amb una relació de producte obtingut respecte el medi utilitzat menor, són els que es desenvolupen en dues etapes, perfusió i infecció en continu. En aquests casos també s’observa que a menor temps de residència, tot i que la concentració de producte en el brou de sortida sigui menor, a nivell de la relació entre la proteïna obtinguda i el volum de medi necessari augmenta. En ambdós casos, a mesura que s’augmenta el temps de funcionament del bioprocés, aquesta relació augmenta, de forma similar al que passava en els cultius amb dues etapes i infecció discontinua. Aquest fet és raonable, degut a que la porció de medi necessari per a desenvolupar els primers estadis de la perfusió es reparteix en les diferents operacions d’infecció de la segona etapa. Això significa que la millora que s’obté a mesura que s’augmenta les etapes d’infecció, s’ha d’estabilitzar, tal i com es pot observar en els valors de proteïna total entre el volum de medi total dels processos de dues etapes amb la infecció en discontinu. Així doncs, de la taula se’n pot extreure la conclusió que el bioprocés que ofereix una major concentració de producte (VP2) referida al volum de medi total utilitzat, i comptant que el medi és la meitat del cost de producció, hauria de ser el bioprocés amb més rendibilitat. En el cas estudiat aquest correspon al cultiu en discontinu infectat amb una MOI de 0,05, que assoleix una concentració de 43 μg/mL. El bioprocés que ofereix la segona millor opció correspon al sistema de dues etapes amb la infecció en discontinu, però a part de la menor concentració de producte per volum de medi necessari, també implica un increment del nombre d’equips necessaris, raó per la qual es descarta d’un inici l’estudi de la seva avaluació econòmica.
5.8.
Bibliografia.
Aucoin, M G; Perrier, M i Kamen, A. 2006. Production of adeno-associated viral vectors in insect cells using triple infection: optimization of baculovirus ratios. Biotechnology and Bioengineering.
Barnes, D i Sato, G. 1980. Methods for growth of cultured cells in serum free medium. Analytical Biochemistry. 102:255-270.
Bedard, C; Tom, R i Kamen, A. 1993. Growth, nutrient consumption and end-product accumulation in Sf9 and BTI-EAA insect cell cultures: Insights into growth limitation and metabolism. Biotechnology Progess. 9:615-624.
Behrendt, U; Koch, S; Gooch, DD; Steegmans, U i Comer, MJ. 1994. Mass spectrometry: a tool for on-line monitoring of animal cell cultures. Cytotechnology. 14:157-165.
Bernard, AR; Lusti-Narasimhan, M; Radford, KM; Hale, RS; Sebille, E i Graber, P. 1996. Downstream processing of insect cell cultures. Cytotechnology. 20:239-257.
Bhatia, R; Jesionowski, G; Ferrance, JP i Ataai, M. 1996. Insect cell physiology. Citotechnology. 20:33-41.
Bibila, TA; Ranucci, CS; Glazomitsky, K; Buckland, BC i Aunins, JG. 1994. Monoclonal antibody process development using medium concentrates. Biotechnology Progress. 10:87-96.
Bittner, C; Wehnert, G i Scheper, T. 1998. In situ microscopy for on-line determination of biomass. Biotechnology and Bioengineering. 60:24-35.
Blissard, GW i Rohrmann, GF. 1990. Baculovirus diversity and molecular biology. Annual Review Entomology. 35:127-155.
Campmajó, C; Cairó, JJ; Sanfeliu, A; Martinez, E; Alegret, S i Gòdia, F. 1994. Determination of ammonium and L-glutamine in hybridoma cell cultures by sequential flow injection analysis. Cytotechnology. 14:177-182.
Casablancas, Antoni. 2001. Optimització del consum de nutrients i generació de subproductes en cultius in vitro de cèl·lules animals. Tesi Doctoral. Universitat Autònoma de Barcelona.
Dorresteijn, RC; Harbrink, KN; Gooljer, CD; Tramper, J i Beuvery, EC. 1996. On-line estimation of the biomass activity during animal-cell cultivations. Biotechnology and Bioengineering. 50:206-214.
Eyer, K i Heinzle, E. 1996. On-line estimation of viable cells in a hybridoma culture at various DO levels using ATP balancing and redox potential measurement. Biotechnology and Bioengineering:277-283.
Eyer, K; Oeggerli, A i Heinzle, E. 1995. On-line gas analysis in animal cell cultivation: II. Methods for oxygen uptake rate estimation and its application to controlled feeding of glutamine. Biotechnology and Bioengineering. 45:54-62.
Faulkner, P i Carstens, EB. 1986. An overview of the structure and replication of baculoviruses. In: The molecular biology of baculoviruses;SpringerVerlag. Berlin-New York. 1-17.
Ferrance, JP; Goel, A i Ataai, M. 1993. Utilization of glucose and aminoacids in insect cell cultures: Quantifying the metabolic flows within the primary pathways and medium development. Biotechnology and Bioengineering. 54:697-707.
Finn, B.; Harvey, L. M. i McNeil, B. 2006. Near-infrared spectroscopic monitoring of biomass, glucose, ethanol and protein content in a high cell density baker's yeast fed-batch bioprocess. Yeast. 23:507-517.
Francki, RIB; Fauquet, CM; Knudson, DL i Brown, F. 1991. Fifth report of the International Comité on Taxonomy of viruses. Berlin.
Freshney, RI. 1989. Animal cell culture: a practical approach. IRL Press. Oxford, Washintong DC.
Gàmez, X. 2000. Estudi estratègies de cultiu per a cèl.lules d’animals, basades en eines d’instrumentació i control. Tesi Doctoral. Universitat Autònoma de Barcelona.
Glassy, MC; Tharakan, JP i Chau, PC. 1988. Serum free media in hybridoma culture and monoclonal antibody production. Biotechnology and Bioengineering. 32:1015-1028.
Granados, RR i Williams, KA. 1986. In vivo infection and replication of baculoviruses.The Biology of Baculoviruses. CRC: 90-127.
Guan, Y; Evans, ME i Kemp, RB. 1998. Specific heat flow rate: an on-line monitor and potential control variable of specific metabolic rate in animal cell culture that combines microcalorimetry with dielectric spectroscopy. Biotechnology and Bioengineering. 58:464-477.
Guarino, LA i Summers, MD. 1986. Functional mapping of a trans-activating gene required for expression of a baculovirus delayed-early gene. Virology. 57:563-571.
Henry, O; Dormond, E; Perrier, M i Kamen, A. 2004. Insights into adenoviral vector production kinetics in acoustic filter-based perfusion cultures. Biotechnology and Bioengineering. 86:765-774.
Higareda, AE; Possani, LD i Ramirez, OT. 1997. The use of culture redox potential and oxygen uptake rate for assessing glucose and glutamine depletion in hybridoma cultures. Biotechnology and Bioengineering. 56:555-563.
Hink, WF i Bezanson, DR. 1985. Invertebrate cell culturemedia and cell lines. Technology of Life Science. Ireland 1-30.
Hink, WF i Hall, RL. 1989. Recently established invertabrate cell lines. In: Cell systems aplications. CRC-press, editor: 269-293.
Jorgensen, EB; Casablancas, A; González, G i Gòdia, F. 1997. On-line monitoring of glutamine and ammonium in mammalian-cell cultures. In: From Vaccines to Genetic Medicine;Kluwer Ac Pub. Dordeht, The Netherlands. 429-434.
Kamen, A.A.; Bédard, C.; Tom, R.; Perret, S i Jardin, B. 1996a. On-line monitoring of Respiration in Recombinant-baculovirus infected and uninfected insect cell bioreactors cultures. Biotechnol. Bioeng. 50:36-48.
Kamen, A.A.; Bédard, C.; Tom, R.; Perret, S i Jardin, B. 1996b. On-line monitoring of Respiration in Recombinant-baculovirus infected and uninfected insect cell bioreactors cultures. Biotechnology and Bioengineering. 50:36-48.
King, GA; Daugulis, AJ; Faulkner, P i Goosen, MFA. 1992. Recombinant ß-galactosidase production in serum-free medium by insect cells in a 14-L airlift bioreactor. Biotechnology progress. 8:567-571.
Klöppinger, M; Fertig, G; Fraune, E i Miltenburger, HG. 1990. Multistage production of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus insect cell cultures. Cytotechnology. 4:271-278.
Konstantinov, KB; Pambayun, R; Matanguihan, R; Yoshida, T; Perusich, C i Hu, WS 1992. On-line monitoring of hybridoma cell growth using a laser turbidity sensor. Biotechnology and Bioengineering. 40:1337-1342.
Kurokawa, H; Park, YS; Lijima, S i Kobayashi, T. 1994. Growth characteristics in fed-batch culture of hybridoma cells with control of glucose and glutamine concentrations. Biotechnology and Bioengineering. 44:95-103.
Lecina, M; Soley, A; Gràcia, J; Espunya, E; Lázaro, B; Cairó, JJ i Gòdia, F. 2006. Application of on-line OUR measurements to detect actions points to improve baculovirus-insect cell cultures in bioreactors. Journal of Biotechnology. 125:385-394.
Lehninger, A. L. 1975. Biochemistry. 2nd edition. Worth. New York.
Lovrecz, G i Gray, P. 1994. Use of on-line gas analysis to monitor recombinant mammalian cell cultures. Cytotechnology. 14:167-175.
Maiorella, B; Inlow, D; Shauger, A i Hrano, D. 1988. Large-scale insect cell culture for recombinant protein production. Bio/Technology. 6:1406-1410.
Martínez-Torrecuadrada, JL; Lázaro, B; Rodríguez, JF i Casal, JI. 2000. Antigenic propierties and diagnostic potencial of baculovirus-expressed infectiuos Buresal disease virus proteins. Clinical Diagnostic Laboratory Immunology. 7:645-651.
Maruniak, JE. 1996. Productivity of insect cells for recombinant proteins. Cytotechnology. 20:145-148.
Maurer. 1986. Towards chemically-defined, serum-free media for mammalian cell culture. A Freshney, editor. IRL Press. Oxford, Washington DC: 13-31.
Meghrous, J; Aucoin, MG; Jacob, D; Chanhal, PS; Arcand, N i Kamen, A. 2005. Production of recombinant adeno-associated viral vectors using a baculovirus/insect cell suspension culture system: From shake flasks to 20-L bioreactor. Biotechnology Progress. 21:154-160.
Menge, U; Fraune, E; Lehmann, J i Kula, M R. 1987. Purification of proteins from cell culture supernatants. Developments in biological standardization. 66 391-401.
Miller. 1997. The Baculoviruses. Plenum Press. New York.
Miller, DW; Safer, P i Miller, LK. 1986. An insect baculovirus host-vector for high-level expression of foreign genes. Genetic Engineering. 8:277-298.
Mitsuhashi, J. 1982. Media for insect cell cultures. Advances in cell culture 2. Maramorosch ed. New York.
Ogonah, O; Shuler, ML i Granados, RR. 1991. Protein production (β-galactosidase) from a
baculovirus vector in Spodoptera frugiperda and Trichoplusia cells in suspension culture. Biotecnology Letters. 13:265-270.
Olsson, L i Nielsen, J. 1997. On-line and in situ monitoring of biomass in submerged cultivations. Trends in Biotechnology. 15:517-522.
Ozturk, SS; Thrift, JC; Blackie, JD i Naveh, D. 1997. Real-time monitoring and control of glucose and lactate concentrations in a mammalian cell perfusion reactor. Biotechnology and Bioengineering. 53:372-378.
Palomares, L.A. i Ramírez, O.T. 1996. The effect of dissolved oxygen tension and the utility of oxygen uptake rate in insect cell culture. Cytotechnology. 22:225-237.
Ranade, A. 2001. Sectoral note. Biotechnology industry. Ireland.
Reuveny, S; Kim, YJ; Kemp, CW i Shiloach, J. 1993. Effect of temperature and oxygen on cell growth and recombinant protein production in insect cell cultures. Applied Microbiology Biotechnology. 38:619-623.
Schopf, B; Howaldt, MW i Bailey, JE. 1990. DNA distribution and respiratory activity of
Spodoptera frugiperda populations infected with wild-type and recombinant Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Journal of Biotechnology. 15:169-186.
Scott, RI; Blanchard, JH i Ferguson, JR. 1992. Effects of oxygen on recombinant protein production by suspension cultures of Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insect cells. Enzyme and microbial technology. 14:798-804.
Shacter, E. 1989. Serum-free media for bulk culture of hibridoma cells and the preparation of monoclonal antibodies. Trends Biotechnol. 7.
Smith, GE; Frasier, MJ i Summers, MD. 1983. Molecular engineering of the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus genome: deletion mutations within the polyhedrin gene. Virology. 46:584-593.
Soley, A. 2002. Estudi de cultius d’hibridomaen continu amb perfusió. Tesi Doctoral. Universitat Autònoma de Barcelona.
Tsao, Y. S.; Cardoso, A. G.; Condon, R. G. G.; Voloch, M.; Lio, P.; Lagos, J. C.; Kearns, B. G. i Liu, Z. 2005. Monitoring Chinese hamster ovary cell culture by the analysis of glucose and lactate metabolism. Journal of Biotechnology. 118:316-327.
Vlak, JM; Schouten, A; Usmany, M; Belsham, GJ; Klinge-Roode, EC; Maule, A; Van Lent, JW i Zuidema, D. 1990. Expression of cauliflower mosaic virus gene I using a baculovirus vector based upon the p10 gene and a novel selection method. Virology. 178:312-320.
Volkman, LE. 1986. The 64K envelope protein of budded Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. In: The molecular biology of baculoviruses;SpringerVerlag. Berlin-New York. 103-118.
Wang, J; Honda, H; Lenas, P; Watanabe, H i Kobayashi, T. 1995. Effective tPA production by BHK cells in nutrients-controlled culture using an on-line HPLC measuring system. Journal of Fermentation and Bioengineering. 80:107-110.
Wilson, ME; Mainprize, TH; Friesen, PD i Miller, LK. 1987. Location, transcription and sequence of a baculovirus gene encoding a small arginine-rich polypeptide. Journal of Virology. 61:661-666.
Wong, TK; Nielsen, LK; Greenfield, PF i Reid, S. 1994. Relationship between oxygen uptake rate and time of infection of Sf9 insect cell infected with a recombinant baculovirus. Cytotechnology. 15:157-167.
Wu, P; Ozturk, SS; Blackie, JD; Thrift, JC; Figueroa, C i Naveh, D. 1995. Evaluation and applications of optical cell density probes in mammalian cell bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 45:495-502.
Xu, Y. H.; Sun, J. J.; Mathew, G.; Jeevarajan, A. S. i Anderson, M. M. 2004. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87:473-477.
Yoon, S i Konstantinov, KB. 1994. Continuous, real-time monitoring of the oxygen uptake rate (OUR) in animal cell bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 44:983-990.
Zeiser, A.; Elias, C. B.; Voyer, R.; Jardin, B. i Kamen, A. A. 2000. On-Line Monitoring of Physiological Parameters of Insect Cell Cultures during the Growth and Infection Process. Biotechnology Progess. 16:803-808.
Zhang, J; Kalogerakis, N; Behie, LA i Latrou, K. 1992. Investigation of reduced serum and serum-free media for the cultivation of insect cells (Bm5) and the production of baculovirus
(BmNPV). Biotechnology and Bioengineering. 40:1165-1172.
Zhou, W; Chen, CC; Buckland, B i Aunins, J. 1997. Fed-batch culture of recombinant NSO myeloma cells with high monoclonal antibody production. Biotechnology and Bioengineering. 55:783-792.
Zhou, W i Hu, WS. 1994. On-line characterization of a hybridoma cell culture process. Biotechnology and Bioengineering. 44:170-177.