Rhodnius prolixus
posee un complemento cromosómico diploide 2n=20A+XY/XX (macho/hembra), con tres pares de autosomas mayores, seis de tamaño intermedio y uno menor, siendo el cromosoma X de tamaño mediano y el cromosoma Y el más pequeño. Durante la primera división meiótica, los II autosómicos presentan un quiasma en posición terminal y se dividen reduccionalmente, mientras que los cromosomas sexuales son asinápticos y aquiasmáticos y se dividen ecuacionalmente (Barth, 1956; Schreiber y Pellegrino, 1950; Ueshima, 1966b).Al realizar la técnica de FISH utilizando como sonda ADNr 18S se observa que dos cromosomas presentan señal de hibridación en prometafase oogonial (Figura 54a). Sin embargo, en prometafase espermatogonial sólo un cromosoma del complemento presenta señal de hibridación (Figura 54b). El análisis de la meiosis del macho permite corroborar que los genes de ADNr se ubican en el cromosoma sexual X (Figura 54c-f). Durante paquitene, el cromosoma sexual X condensado y DAPI positivo muestra una señal de hibridación en posición terminal (Figura 54c). En diacinesis y metafase I, el univalente sexual X tiene una señal de hibridación (Figura 54d-e). En metafase II se distingue que la sonda de ADNr hibrida sólo en el cromosoma X, el cual se asocia al cromosoma Y formando un pseudobivalente (Figura 54f).
CAPITULO IV Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 117 | P á g i n a
Figura 54: Rhodnius prolixus (2n=20A+XY/XX). a-f. FISH con sonda de ADNr 18S. a. Prometafase oogonial, b. Prometafase espermatogonial, c. Paquitene, d. Diacinesis, e. Metafase I, f. Metafase II. Señal de hibridación
(rojo), cromosomas contrateñidos con DAPI (azul). X, Y: cromosomas sexuales. Barra: 10 µm.
Análisis de sitios de actividad cinética mediante FISH
La localización de las señales de hibridación de la sonda de ADNr 18S en los bivalentes autosómicos mayores de
Microtomus lunifer
,Graptocleptes bicolor
yZelus obscuridrorsis
permitió utilizar a losclusters
de genes ribosomales como un marcador cromosómico para analizar el comportamiento meiótico de estos cromosomas (Figuras 48-50). En las tres especies, la presencia de señales de hibridación en uno de los extremos de cada cromosoma homólogo del bivalente autosómico permite distinguir si el extremo portador de la región NOR es cinéticamente activo o no durante ambas divisiones meióticas.En
M. lunifer
, el bivalente mayor se orienta axialmente y muestra dos tipos de configuraciones en metafase I: cuando el extremo portador de la señal de hibridación se orienta hacia los polos (Figuras 48f, 55a) y cuando el extremo que no porta la señal se orienta hacia los polos (Figuras 48g,h, 55b). En metafase II, las cromátides hermanas alcanzan una orientación axialCAPITULO IV Poggio, María Georgina
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y presentan las mismas configuraciones que en metafase I: extremos con señal de hibridación (Figuras 48j, 55c) y extremos sin señal de hibridación (Figuras 48i, 55d) se disponen hacia los polos.
Figura 55: Microtomus lunifer. a-d. Fotos (izquierda) y diagramas (derecha) ilustrando las dos orientaciones alternativas del par autosómico portador de los clusters de ADNr: a-b. Metafase I, c-d.
Metafase II. Cromosomas en azul. Señal de hibridación-ADNr en rojo.
Con el fin de poner a prueba si la elección de los extremos cinéticamente activos es un proceso azaroso tanto en metafase I como en metafase II y si existe o no inversión de la actividad cinética entre la primera y la segunda división meiótica, i.e. el extremo que fue activo en la primera división es inactivo en la segunda y viceversa, se calcularon las frecuencias con las que se observó cada una de las configuraciones en tres individuos. Los resultados muestran que en metafase I la actividad cinética está restringida más frecuentemente al extremo que no porta la señal de hibridación. Sin embargo, en metafase II se observa que es más frecuente que el extremo activo sea aquel portador de la señal de hibridación (Tabla 6). Más aún, si se compara la frecuencia de las células en las que el II marcador presenta actividad cinética en el extremo que no porta la señal en metafase I con la frecuencia de las células en las que el cromosoma marcador presenta actividad cinética en el extremo portador de la señal en metafase II, se pueden observar frecuencias similares (y viceversa) (Tabla 6).
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Tabla 6: Microtomus lunifer. Frecuencia de células en metafase I y metafase II mostrando actividad cinética en la región terminal portadora de ADNr (configuraciones a y c) o en la región terminal que no lo
porta (configuraciones b y d).
El análisis estadístico mediante una prueba de Chi-cuadrado (X2) corrobora las hipótesis previamente descriptas:
1. La elección de los extremos cromosómicos activos NO es un proceso azaroso tanto en metafase I como en metafase II (X2(ejemplar 1, meta I)= 19,5; X
2
(ejemplar 1, meta II)= 23,5; X 2
(ejemplar 2, meta I)= 7,71; X
2
(ejemplar 2, meta II)= 7,11; X 2
(ejemplar 3, meta I)= 13,16; X 2
(ejemplar 3, meta II)= 13,53 >
VC(GL=1; α=0,05)=3,84).
2. Existe inversión de la actividad cinética entre ambas divisiones meióticas (X2(ejemplar 1)= 3,49;
X2(ejemplar 2)= 8,82x10 -4
; X2(ejemplar 3)= 2,38 < VC(GL=1; α=0,05)=3,84).
Al igual que en
M. lunifer
, se calcularon las frecuencias con las que se observó cada una de las configuraciones en tres individuos deG. bicolor
(Configuraciones a-d: ver Figura 55). Los resultados muestran que en metafase I la actividad cinética está restringida más frecuentemente al extremo que porta la señal de hibridación. Sin embargo, en metafase II se observa que es más frecuente que el extremo activo sea aquel que no porta la señal (Tabla 7).Tabla 7: Graptocleptes bicolor. Frecuencia de células en metafase I y metafase II mostrando actividad cinética en la región terminal portadora de ADNr (configuraciones a y c) o en la región terminal que
no lo porta (configuraciones b y d).
Metafase I Metafase II
Ejemplar Configuración a Configuración b Total Configuración c Configuración d Total
1 8 3 11 2 3 5 Frec. 0,73 0,27 1 0,4 0,6 1 2 29 1 30 0 4 4 Frec. 0,97 0,03 1 0 1 1 3 5 1 6 3 5 8 Frec. 0,83 0,17 1 0,37 0,63 1 Metafase I Metafase II
Ejemplar Configuración a Configuración b Total Configuración c Configuración d Total
1 24 66 90 40 7 47 Frec. 0,27 0,73 1 0,85 0,15 1 2 12 30 42 26 10 36 Frec. 0,29 0,71 1 0,72 0,28 1 3 70 120 190 51 20 71 Frec. 0,37 0,63 1 0,72 0,28 1
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Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 120 | P á g i n a
En
Z. obscuridorsis
se calcularon las frecuencias con las que se observó cada una de las configuraciones en tres individuos (Configuraciones a-d: ver Figura 55). Los resultados muestran que en metafase I la actividad cinética está limitada sólo al extremo que porta la señal de hibridación, i.e. no se observaron células en metafase I donde el extremo sin señal sea activo, mientras que en metafase II es más frecuente que el extremo activo sea aquel que no porta la señal de hibridación (Tabla 8).Tabla 8: Zelus obscuridorsis. Frecuencia de células en metafase I y metafase II mostrando actividad cinética en la región terminal portadora de ADNr (configuraciones a y c) o en la región terminal que
no lo porta (configuraciones b y d).
Metafase I Metafase II
Ejemplar Configuración a Configuración b Total Configuración c Configuración d Total
1 21 0 21 0 1 1 Frec. 1 0 1 0 1 1 2 25 0 25 4 14 18 Frec. 1 0 1 0,2 0,8 1 3 12 0 12 0 0 0 Frec. 1 0 1 - - - DISCUSIÓN Número y localización de ADN ribosomal
Hasta el presente, en la familia Reduviidae el número y la localización cromosómica de los genes de ADNr han sido analizados en 42 especies mediante la técnica de hibridación
in situ
fluorescente con sondas de ADNr 18S, 26S y 45S (Tabla 9). El presente trabajo de Tesis Doctoral representa un gran aporte a la citogenética de los redúvidos dado que el número y la localización precisa de los
loci
de ADNr 18S se han estudiado por primera vez en especies de las subfamilias Ectrichodiinae (Brontostoma discus
), Hammacerinae (Microtomus lunifer
) y Harpactorinae (Cosmoclopius annulosus
,Atrachelus (Atrachelus) cinereus
,Apiomerus lanipes
,Graptocleptes
bicolor
yZelus obscuridorsis
) (Tabla 9). En el caso particular deRhodnius prolixus
, los resultados obtenidos en el presente trabajo concuerdan con lo previamente descripto por Panzera y colaboradores (2008; 2012) (Tabla 9).En siete de las ocho especies aquí analizadas, los
clusters
de ADNr se ubican en una de las regiones terminales de un par autosómico y/o de los cromosomas sexuales; sin embargo, enCAPITULO IV Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 121 | P á g i n a
Por otra parte, las seis especies en las que los genes ribosomales se localizan en autosomas, estos siempre son los más grandes o se encuentran entre los más grandes del complemento.
En
M. lunifer, G. bicolor
yZ. obscuridorsis
también se realizó la técnica de bandas secuenciales fluorescentes, detectándose sólo enM. lunifer
que la NOR colocaliza con una banda CMA3 positiva. Del mismo modo, enRhodnius pallescens
Barber (Morielle-Souza y Azeredo-Oliveira, 2007),
Triatoma platensis
,T. tibiamaculata
(Pinto) (Dias de Campos Severi-Aguiar y Vilela de Azeredo-Oliveira, 2005),T. matogrossensis
Leite, Barbosa (Bardella et al., 2010) yT. vitticeps
(Stål) (Severi-Aguiar et al., 2006) también se ha descripto la colocalización de las NORs con bandas CMA3 positivas, lo que evidencia que la unidad de repetición ADNr sería rica en pares de bases
GC. El número de especies en las que se realizaron ambas técnicas citogenéticas es bajo, por lo que habría que estudiar un mayor número de especies de modo de dilucidar si las unidades de repetición de ADNr ricas en GC son una característica frecuente o bien una excepción en esta familia.
Sobre la base de las hipótesis planteadas y discutidas en Cimicidae (ver CAPITULO IVa) y los resultados obtenidos por Panzera y colaboradores (2012), en el trabajo llevado a cabo en 38 especies de triatominos, es relevante señalar que la localización y el número de
clusters
de ADNr exhiben una variabilidad interespecífica notable (Tabla 9). Asimismo, esta variación conspicua revela que habría acontecido una dinámica considerable en el genoma de Reduviidae durante su evolución. Los cambios en la localización del ADNr podrían ser la consecuencia tanto de reordenamientos cromosómicos, que implican modificaciones en el número de cromosomas (Bressa et al., 2009; Hirai et al., 1996), como transposición (Schubert, 1984; Schubert y Wobus, 1985) y/o recombinación ectópica (Hanson et al., 1996). En particular, en especies de triatominos la existencia de asociaciones cromosómicas heterólogas que dan lugar a la presencia de cromocentros, facilitarían la ocurrencia de recombinación ectópica y transposición (Panzera et al., 2012).CAPITULO IV Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 122 | P á g i n a
Tabla 9: número y localización de ADNr mediante FISH en la familia Reduviidae. Se detalla: nombre del género, subfamilia a la que pertenece, número cromosómico diploide (2n), cromosoma en el que mapea el cluster de
ADNr (A: autosoma, Sex: cromosoma sexual, X: cromosoma sexual X, Y: cromosoma sexual Y), región del cromosoma en la que se ubica (t: región terminal, st: región subterminal, ?: no se describió la ubicación), colocalización de la señal de ADNr con una banda CMA3 (CMA3+: ADNr colocaliza con una banda CMA3
positiva, CMA3-: ADNr colocaliza con una banda CMA3 negativa), entre paréntesis: número de especies
analizadas.
Género Subfamilia 2n
Localización Colocalización
Referencia FISH-ADNr banda CMA3
Brontostoma (1) Ectrichodiinae 34A+X1X2Y A t No se hizo Presente trabajo
Microtomus (1) Hammacerinae 26A+2m+X1X2Y A t CMA3+ Presente trabajo
Cosmoclopius (2) Harpatorinae 24A+X1X2X3Y A, Y t
No colocaliza (1) No se hizo (1)
Poggio, 2007 (1) Presente trabajo (1) Graptocleptes Stål
(1) Harpatorinae 22A+XY A st No colocaliza Presente trabajo
Zelus (1) Harpatorinae 16A+XY A t No colocaliza Presente trabajo
Atrachelus (1) Harpatorinae 26A+XY A, Sex t No se hizo Presente trabajo Apiomerus (1) Harpatorinae 22A+XY X, Y t No se hizo Presente trabajo
Rhodnius Stål (4) Triatominae 20A+XY X (2) X, Y (2) ? t CMA3+ (1) No se hizo (3) Morielle-Souza y Azeredo-Oliveira, 2007 (1) Panzera et al., 2012 (4) Presente trabajo (1) Dipetalogaster
Usinger(1) Triatominae 20A+XY X ? No se hizo Panzera et al., 2012 Eratyrus (Stål) (1) Triatominae 20A+X1X2Y X, Y ? No se hizo Panzera et al., 2012
Mepraia Mazza,
Gajardo & Jörg (2) Triatominae 20A+X1X2Y X ? No se hizo Panzera et al., 2012 Panstrongylus Berg (3) Triatominae 18A+X1X2Y (1) 20A+X1X2Y (2) A (2) A, Sex (1) t No colocaliza (1) No se hizo (2) Morielle-Souza y Azeredo-Oliveira, 2007 (1) Panzera et al., 2012 (3) Psammolestes
Bergroth (1) Triatominae 20A+XY X, Y ? No se hizo Panzera et al., 2012
Triatoma (29) Triatominae 18A+X1X2Y (1) 20A+XY (18) 20A+X1X2Y (9) 20A+X1X2X3Y (1) X (7) X, Y (4) A (18) A, Sex (1) t (3) ? (26) CMA3+ (4) CMA3- (1) No colocaliza (3) No se hizo (21)
Dias de Campos Severi-Aguiar y Vilela de Azeredo-Oliveira, 2005 (3) Severi-Aguiar et al., 2006 (1) Bardella et al., 2010 (4) Panzera et al., 2012 (29)
CAPITULO IV Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 123 | P á g i n a
Sitios alternativos de actividad cinética
Como se describió en el CAPITULO II,
A. lanipes
posee un par autosómico marcadamente mayor al resto de los cromosomas del complemento que presenta una constricción secundaria en la región media. Además, este par cromosómico posee en general dos quiasmas tanto en diacinesis como en metafase I, por lo que se ha propuesto que en este bivalente mayor se activarían sitios de actividad cinética alternativos situados en la parte media del cromosoma (constricción secundaria) (Poggio et al., 2007). Papeschi y colaboradores (2003) propusieron que en organismos con cromosomas holocinéticos y meiosis pre-reduccional, como es el caso de Heteroptera, no sólo las regiones terminales son capaces de unirse a las fibras del huso, sino también las constricciones secundarias o bien los sitios cercanos a ellas. En particular, el bivalente en anillo que presentaNezara viridula
(Pentatomomorpha: Pentatomidae) posee una constricción secundaria portadora de la región organizadora nucleolar. Estas secuencias de ADN repetitivo o las regiones adyacentes, serían las que se vuelven funcionales uniéndose a las fibras del huso y actuando como sitios alternativos de actividad cinética (Papeschi et al., 2003). Con el fin de analizar si los sitios alternativos de actividad cinética ubicados en la región media del bivalente mayor enA. lanipes
requieren de una constricción secundaria y de secuencias de ADNr, se realizó la técnica de FISH. De los resultados obtenidos se desprende que dichas secuencias están presentes en los cromosomas sexuales X e Y y ausentes en la constricción secundaria del par mayor. En otras palabras, los sitios alternativos de actividad cinética del bivalente mayor de
A. lanipes
se corresponderían con una constricción secundaria no organizadora nucleolar.Comportamiento meiótico y análisis de la actividad cinética en los bivalentes portadores de ADNr La utilización de la técnica de hibridación
in situ
fluorescente con una sonda específica como marcador cromosómico en especies con cromosomas holocinéticos es de gran importancia debido tanto a la ausencia de un centrómero diferenciado morfológicamente como a la escasa diferenciación cromosómica longitudinal.En dos especies de Coreidae (Pentatomomorpha),
Carlisis wahlbergi
Stål yCamptischium
clavipes
(Fabricius), la mayoría de los entrecruzamientos en los bivalentes autosómicos portadores de la NOR ocurren en la región contraria a donde se localizan los loci de ADNr. Los autores sugieren que las NORs podrían actuar como inhibidores de los entrecruzamientos en las regiones cercanas a los genes de ADNr (Cattani et al., 2004; Fossey y Liebenberg, 1995). Esto mismo se observó en el bivalente de tamaño mayor portador de la NOR deG. bicolor
, el cual posee, con mayor frecuencia, un quiasma en la región distal al extremo donde se localiza el ADNr. Más aún,CAPITULO IV Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 124 | P á g i n a
los resultados obtenidos en el presente trabajo de Tesis revelaron que en
Z. obscuridorsis,
el bivalente mayor portador de la NOR sólo presentó quiasmas en el extremo opuesto al extremo donde mapea el ADNr, representando un caso extremo del efecto inhibidor de las NORs en la posición de los quiasmas. Por el contrario, enM. lunifer
el bivalente autosómico mayor portador de la NOR, al igual que lo descripto previamente enNezara viridula
(Camacho et al., 1985), el quiasma se localizó con mayor frecuencia en las regiones cercanas a la región NOR. Por todo lo expuesto, si bien los genes de ADNr podrían tener efectos sobre la posición de los quiasmas, se podría inferir que estas secuencias en sí mismas no estarían interfiriendo en la recombinación meiótica de estas especies dado que no hay consistencia en su efecto inhibidor.En las especies