La posibilidad de evaluar el efecto antiapoptótico de las variantes de rhEPO sobre un cultivo primario de neuronas corticales permite estudiar el efecto de dichas drogas sobre células cuyo metabolismo no se encuentra alterado como en las líneas celulares establecidas. Por tal motivo, es un modelo interesante ya que se aproxima de una forma más real a lo que ocurriría in vivo en el cerebro. Además, la selección del cultivo de neuronas corticales fue hecha sobre la base de que estas células han mostrado la expresión del EPOR y han sido ampliamente utilizadas para estudiar el efecto neuroprotector de la EPO (Andoh y col., 2011; Digicaylioglu y col., 1995; Morishita y col., 1997; Ruscher y col., 2002; Taoufik y col., 2008).
Para evaluar el efecto de las variantes de rhEPO en este modelo, lo primero que se determinó fue el porcentaje de neuronas presentes en los cultivos primarios generados con el fin de corroborar si la metodología empleada para obtener las neuronas corticales había sido apropiada. Para poner en evidencia la cantidad de neuronas presentes en el cultivo se evaluó la presencia de la proteína MAP2 mediante inmunofluorescencia, dado que ésta corresponde a una serie de proteínas asociadas a microtúbulos exclusiva de células nerviosas. Simultáneamente, se analizaron los cambios a nivel de la condensación de la cromatina mediante tinción del ADN con el fluorocromo Hoechst 33258.
Tal como se procedió para las células SH-SY5Y, en primer lugar, se seleccionó la concentración de CoCl2 que permitiese obtener una diferencia significativa entre el
control de crecimiento y el control de muerte luego de incubar las células durante 24 horas en presencia de dicho agente.
Con ese fin, las células obtenidas de la corteza cerebral de ratas de 1 día de edad se sembraron a una densidad de 1,0-1,6.105 cél.cm-2 y se diferenciaron durante 7
días manteniéndolas en el medio Neurobasal suplementado con B27, L-glutamina y antibióticos. Posteriormente, se indujo apoptosis durante 24 h mediante el agregado de diferentes concentraciones de CoCl2 (0, 100, 200, 400 y 600 µM).
Antes de discutir el efecto de las distintas concentraciones, es importante destacar que se obtuvieron cultivos con un 74 ± 6 % de neuronas corticales, calculado al superponer las imágenes inmunomarcadas con el anticuerpo anti-MAP2 conjugado con fluoresceína y coloreadas simultáneamente con el reactivo Hoechst (Ver Fig. 46). Esta metodología al mismo tiempo posibilitó visualizar claramente la presencia de dendritas e interconexiones entre las neuronas, lo que puso en evidencia que luego de 7 días las células se diferenciaron correctamente.
A
B
C
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El efecto de las diversas concentraciones de CoCl2 se puede observar en la Fig.
47A. Como se pone en evidencia en la curva dosis-respuesta, recién a partir de los 400 µM la diferencia con el control de crecimiento (sin CoCl2) fue significativa
(22,6 ± 3% y 13,1 ± 1%, respectivamente), mientras que entre 400 y 600 µM no existieron diferencias significativas, alcanzando un porcentaje de células apoptóticas del 22,6 ± 3 % y 23,1 ± 1,5 %, respectivamente. Entre ambas concentraciones, se seleccionó 600 µM de CoCl2 para evaluar el efecto de las variantes de rhEPO.
Fig. 46. Evaluación de la diferenciación neuronal.
A. Imagen de las células del control de crecimiento coloreadas sólo
con el colorante Hoechst.
B. Imagen de las células marcadas con anti-MAP2 conjugado con
fluoresceína.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 0 200 400 600 800 0 10 20 30
**
***
Concentración CoCl2(µM) % C é lu la s a p o p tó ti c a sA
B
C
Fig. 47. Efecto de diferentes concentraciones de CoCl2 sobre la muerte
celular en cultivo primario de neuronas corticales.
A. Curva dosis-respuesta (n=3). B. Control de crecimiento.
C. Células tratadas con 600 µM de CoCl2. Grado de significancia
estadística: *** p ≤ 0,001 y ** p ≤ 0,01 comparados con el grupo control (sin agregado de CoCl2). Test ANOVA y test post-ANOVA de
Tukey.
Continuando con la premisa de que para que la rhEPO cumpla su rol citoprotector requiere de pretratamiento, las células fueron tratadas durante 24 h con 395 ng.ml-1 de la nueva molécula y de la rhEPO (50 UI.ml-1).
Una vez transcurrido dicho tiempo, las células fueron expuestas a 600 µM de CoCl2 durante 24 h en presencia de las moléculas y, finalmente, fueron fijadas y
coloreadas con el fluorocromo Hoechst.
En la Fig. 48, se observa que el tratamiento con ambas moléculas redujo significativamente la apoptosis respecto del control de muerte. Sin embargo, a la misma masa, la rhNEPO fue significativamente más efectiva que la rhEPO ya que disminuyó el número de células apoptóticas en un 40 % mientras que la rhEPO sólo en un 25 %, con respecto al mismo control.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 0 50 100 150 ** *** * CoCl2 EPO (ng.ml-1) NEPO (ng.ml-1) - - - + - - + 395 - + - 395 A p o p to si s re la ti v a
Fig. 48. Efecto protector de la rhNEPO sobre el cultivo primario de neuronas corticales sometidas a apoptosis con CoCl2 600 µM durante 24h.
El porcentaje de células apoptóticas se determinó mediante el recuento de ~ 500 células. Los valores se expresan como apoptosis relativa al control de muerte. Grado de significancia estadística: *** p ≤ 0,001, ** p ≤ 0,01 y * p ≤ 0,05 comparados con el grupo sometido a apoptosis sin ningún tratamiento (n=3). Test ANOVA y test post-ANOVA de Tukey.
Estos resultados están en concordancia con estudios previos realizados in vitro empleando un cultivo primario de neuronas donde se ha mostrado que la rhEPO protege las células de la muerte celular inducida por hipoxia o por glutamato (Juul y col., 1998; Morishita y col., 1997; Xu y col., 2009).
En condiciones de hipoxia se ha demostrado que se genera un incremento de glutamato (Morishita y col., 1997; Nicotera y Lipton, 1999). Por lo tanto, considerando que el inductor de apoptosis empleado en este modelo fue el CoCl2, un inductor
químico de hipoxia, se podría suponer que uno de los mecanismos responsables de este efecto neuroprotector observado por parte de las variantes de rhEPO estaría relacionado con las propiedades antineurotóxicas reportadas para la hormona hematopoyética.
Xu y col. (2009) postularon que el modo de acción de la rhEPO para prevenir el daño hipóxico inducido en neuronas corticales probablemente proceda de su potencial para prevenir la liberación de glutamato así como también atenuando la excitotoxicidad mediada por el receptor NMDA (N-metil-(D)-aspartato). Otro posible mecanismo propuesto podría estar relacionado con la modulación inducida por EPO del flujo de calcio intracelular inducido por glutamato, pero aún no está dilucidado completamente. Estudios recientes sugieren que la EPO actuaría disminuyendo la entrada de calcio a la célula en condiciones de excitotoxicidad (Andoh y col., 2011).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Por otro lado, se ha demostrado que el CoCl2 en otros cultivos celulares
disminuye la expresión de la proteína Bcl-2, una de las principales proteínas antiapoptóticas, e induce apoptosis a través de la activación de proteínas kinasas y de caspasas (Akita y col., 2007). Asimismo, las propiedades antiapoptóticas de la EPO, evidenciada en un gran número de líneas celulares y cultivos primarios, están asociadas con la capacidad no sólo para regular la relación Bcl-2/Bax sino también para disminuir la expresión del gen Bak e incrementar la expresión de Bcl-XL. Por lo
tanto, se podría postular a este mecanismo molecular como otra vía a través de la cual la nueva variante de rhEPO podría estar ejerciendo su acción.
Cabe destacar que para corroborar esta hipótesis sería necesario profundizar el estudio analizando los mecanismos moleculares mencionados, dado que no se ha evaluado hasta el momento el efecto antiapoptótico de la rhEPO empleando este inductor.
30.3 Rol antiapoptótico de la nueva variante en cultivo de células PC-12