DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1 Síntesis y caracterización de los compuestos
La preparación del compuesto 1 se llevó a cabo por una condensación del p-dimetilamino benzaldehído con tiocromona. El mecanismo y el ataque propuesto (Figura 4.1) consiste en la formación de un c arbanión en posición alfa al grupo carbonilo de la tiocromona y el ataque nucleofílico del carbanión sobre el grupo carbonilo del aldehído aromático.47 La reacción genera un intermediario con el grupo hidroxilo que deshidrata en catálisis básica para generar el
Figura 4.1 Mecanismo propuesto para el compuesto 1.47
El estudio de espectrometría de masas para el compuesto 1 EM (m/z 70eV, M+, abundancia %) indica la presencia de los siguientes iones: 295 (100%), 158 (64%), 143 (32%) 137 (82%).
S O
N
Figura 4.2 Estructura del ion molecular de m/z=295
La presencia del ion m/z =134 se justifica por la pérdida del fragmento radical tiocromil, que con base a la literatura 48 se propone la fragmentación que involucra la ruptura del puente entre la unidad tiocromil y el carbono bencílico.
S
Figura 4.3 Mecanismo propuesto para la formación del ion m/z=134 48
Otro de los fragmentos importantes observados en el espectro de masas es el que posee una relación m/z=147 unidades. La presencia de este ión se justifica a partir de la ruptura homolítica del enlace que se muestra en la figura 4.4 para generar un diradical estabilizado por resonancia con el grupo carbonilo y por la presencia del átomo de azufre que logra su estabilización cediendo uno de sus electrones no enlazantes para la deslocalización del radical.
Prosigue la abstracción de dos hidrógenos del medio por parte de los radicales y la última ruptura homolítica del enlace α al grupo carbonilo para generar de esta forma los fragmentos indicados en la figura 4.4. Tanto el radical localizado en el átomo de carbono del grupo carbonilo, como el radical alílico se encuentran estabilizados por resonancia. 48, 49
S
Figura 4.4 Mecanismo propuesto para la formación del ion molecular de m/z=147 48
El último fragmento analizado corresponde a la relación m/z=158 unidades. Su formación se justifica en base a un proceso análogo a los anteriores pero que comprende la ruptura homolítica del enlace carbono-azufre. El radical azufre generado tras la ruptura logra deslocalizarse sobre el anillo aromático y una vez localizado en el átomo de posición alfa al grupo carbonilo, induce una ruptura alfa sobre el enlace carbono-carbono para generar un catión radical con la relación m/z observada en el espectro.
S
Figura 4.5 Mecanismo propuesto para la formación del ion molecular de m/z=158 48
El mecanismo de ciclización del ácido bencilmercaptoacético al intermediario A por deshidratación del compuesto requiere de pentóxido de fósforo como catalizador. En reacciones de alquilación y esterificación, el pentóxido de fósforo actúa como una especie catalizadora capaz de activar los enlaces dobles y generar ataques nucleofílicos. 47 Sin embargo el mecanismo para este tipo de reacciones no ha sido completamente establecido.
La preparación del compuesto 2 c onsiste en una condensación cuyo mecanismo es análogo al del compuesto 1 (Figura 4.1).
El espectro de resonancia de protones del compuesto 2 muestra un fuerte desplazamiento en la señal singlete, que corresponde al protón vinilico, hacia campo bajo, solapándose con la señal de los protones aromáticos en posición alfa al grupo carbonilo. Esto se debe a la influencia del átomo de azufre, que en el compuesto 2 esta enlazado directamente al doble enlace, actuando
como una especie desapantallante generando así el efecto observado. Por su parte la zona aromática muestra un patrón de señales similar al patrón aromático del compuesto 1.
4.2 Espectros de absorción.
El compuesto 1 presenta una banda de absorción de λmáx 420 nm, ubicada en la zona del visible, y se atribuye a la alta conjugación de enlaces π y la presencia del grupo amino dador.
Los espectros de absorción del compuesto en solventes polares próticos presentan λmáx en 425 nm , mientras que los solventes polares apróticos desplazan la banda a 415 nm . Este comportamiento se atribuye a la posible participación discreta del solvente en la estabilización de los estados excitados y/o estados fundamentales.49
En el caso de CCl4 se observa el desplazamiento hipsocrómico de la banda a 405 nm lo cual, asociado a la baja polaridad del solvente, indica la presencia de un estado excitado de mayor polaridad en comparación con el estado fundamental.
El compuesto 2 posee un espectro de absorción desplazado hacia mayores longitudes de onda en comparación con el espectro del compuesto 1. Se piensa que este desplazamiento se debe al átomo de azufre adyacente al carbono sp2, que participa en la conjugación del sistema π.8
En relación con los solventes, el comportamiento del espectro de absorción es similar al del compuesto 1. En los solventes polares próticos se observa la banda de absorción alrededor de 450 nm mientras que los solventes apolares generan un d esplazamiento hipsocrómico de la banda, en particular en CCl4.
4.3 Estimación del coeficiente de absortividad molar.
Para el compuesto 1 se encontró un estimado de absortividad molar ε = 19000 M-1 cm -1 para λmax 425 nm. El compuesto 1 muestra alta sensibilidad a la excitación con acceso al estado
singlete en λ = 425 nm, y ello implica amplias posibilidades de estudio fotoquímico a b ajas concentraciones con miras a estudios de fotosensibilización.
4.4 Estudio de fotolabilidad del compuesto 1.
Luego de haber efectuado la fotólisis en estado estacionario del compuesto 1, se observa que el compuesto es fotolábil debido a la disminución de la banda de absorción de λmáx 420 nm.
Con base a los resultados se puede concluir que, tras la irradiación del compuesto 1, el cromóforo asociado a la transición en 420 nm sufre una transformación generando compuestos distintos al original.
Por su parte, la banda de absorción ubicada cerca de 250 nm no sufrió un c ambio de intensidad significativo a medida que trascurrían las irradiaciones. En general se observó un leve incremento en la intensidad de absorción de esta banda al aumentar el tiempo de irradiación.
La variación en el enriquecimiento de las atmósferas (O2, N2 y aire) durante la irradiación no generó resultados concluyentes. La velocidad de fotodegradación del compuesto 1, con base al decrecimiento de λmáx 420 nm, tanto en condiciones aeróbicas como en condiciones anaeróbicas, y en atmósfera enriquecida en oxígeno no va ría y en todos los casos el comportamiento del cromóforo es igual. Esto se evidencia en las figuras 3.8, 3.13 y 3.17.
La fotodegradación tanto en metanol como en acetonitrilo tienen aproximadamente la misma velocidad, sin embargo la fotólisis en tetracloruro de carbono se acelera con respecto a las anteriores, lo que se observa en las figuras 3.21, 3.22 y 3.23. A partir de este resultado, se piensa que el proceso de transferencia electrónica ó acceso al estado excitado T1 se encuentra favorecido.
Adicionalmente, la aceleración en la fotodegradación del compuesto 1 en CCl4 también puede estar asociada a un proceso de generación de oxígeno singlete. El tetracloruro de carbono favorece los procesos de cruce intersistema además de incrementar el tiempo de vida media del oxígeno singlete.1 De esta forma se amplían las posibilidades para una interacción química entre
la especie excitada de oxígeno con el compuesto 1 para generar especies de tipo peróxidos o endoperóxidos, los cuáles podrían estar involucrados en la transformación del cromóforo original.
El empleo de BHA y DABCO durante los experimentos de fotodegradación actuando como inhibidores de radicales libres y oxígeno singlete respectivamente, no resultó concluyente.
Las velocidades de fotodegradación resultaron ser equivalentes en presencia y ausencia de estos inhibidores como se observa en la figura 3.20.
4.5 Fotólisis del compuesto 1.
4.5.1 Fotodegradación del compuesto 1. Método A
Las mezclas de fotoproductos obtenida a intervalos de 1,5 h; 3 h ; 4,5 h y 6h d e irradiación presentaron una alta complejidad en el número de bandas observadas en CCF. Al menos seis bandas fueron separadas y el análisis de cada una de ellas por H-RMN, indicó mezcla de compuestos. Con base al análisis de 1H-RMN, se plantea que existe modificación en la estructura del compuesto inicial, por cuanto se observa desaparición de las bandas correspondientes al compuesto inicial. En general se observa la desaparición de las señales asignadas inicialmente al grupo metileno en posición alfa al átomo de azufre y al protón vinílico en la molécula del compuesto 1.
Estos resultados plantean una posible modificación del compuesto 1 principalmente sobre los enlaces que se encuentran señalados en la figura 4.6.
S O
N
Figura 4.6 Demarcación de la zona modificada en la molécula del compuesto 1.
El análisis que corresponde al método A no permite aportar mayor información en cuanto a la estructura obtenida para los fotoproductos generados tras la fotólisis del compuesto 1.
4.5.2 Fotodegradación del compuesto 1. Método B
La mezcla de fotoproductos obtenida mediante la fotodegradación del compuesto 1 bajo el método B mostró el mismo comportamiento que las mezclas analizadas en la sección anterior. En esta oportunidad se logró separar e identificar al compuesto de partida como componente principal dentro de la mezcla de fotoproductos (Residuo 5B), al igual que en el método A (Apéndice AC). El porcentaje de recuperación luego de 6 horas de irradiación del compuesto 1 es de 40%
De nuevo se observa en el espectro de resonancia de una de las bandas aisladas (Residuo 6B Apéndice AI), señales importantes sobre todo en la zona aromática, la cual pareciera ser similar al compuesto de partida. La señal de los protones del grupo metileno no se observan y en su lugar se observan dos singletes. De nuevo se identifica como centro de reactividad al grupo metileno en posición α al átomo de azufre.
4.7.3 Fotodegradación del compuesto 1. Método C.
El trabajo de separación mostró los mismos resultados en cuanto a número de bandas observadas luego del desarrollo de CCF. Sin embargo la fotólisis del compuesto 1 en nitrógeno arrojó como resultado una menor complejidad y una mejor separación de fotoproductos en comparación con los resultados obtenidos en el método B. Esta vez sólo se hizo estudio de 1 H-RMN a las tres bandas mayoritarias.
El apéndice AJ muestra el espectro 1H-RMN de uno d e los compuestos recuperados (Residuo 4C). En este espectro se observan ciertas modificaciones con respecto al espectro del compuesto original. Se observa un cambio en la multiplicidad de lo que se piensa sea la señal de los protones del grupo metileno en posición α al átomo de azufre. La zona aromática cambia significativamente en comparación con el compuesto inicial y el singlete del protón vinílico
desaparece. De nuevo se identifica como zona de reactividad fotoquímica a la indicada en la figura 4.6. No fue posible proponer una estructura al espectro de resonancia discutido.
El apéndice AK corresponde al espectro de resonancia del compuesto inicial que, al igual que en la degradación bajo atmósfera de oxígeno, logró ser aislado como componente principal de la mezcla con un porcentaje de recuperación de 50% luego de 6 horas de irradiación (Residuo 5C).
El apéndice AM muestra el espectro 1H-RMN del otro compuesto aislado (Residuo 6C).
Este espectro muestra señales significativas tanto en la zona aromática como en la zona no aromática. En base a las evidencias obtenidas a partir del estudio de este compuesto, se realizó un análisis de CG-EM del compuesto el cual se muestra en el apéndice AO. Adicionalmente, el espectro masas del compuesto muestra un pico molecular con una relación m/z=295 unidades.
Tanto el fotoproducto como el compuesto inicial exhiben el mismo ion molecular, sin embargo el patrón de fraccionamiento del espectro es distinto. En base a estas observaciones se plantea una isomerización del compuesto inicial para la generación del nuevo compuesto.
Del análisis del espectro de RMN 1H se desprenden los siguientes resultados:
Se observa la desaparición del protón vinílico que originalmente se localizaba cerca de 7,75 ppm.
También se observa la desaparición de la señal que corresponde al grupo metileno en posición α al átomo de azufre.
Aparece una nueva señal localizada cerca de 6,30 ppm.
Aparecen dos señales cerca de 5,18 ppm y 5,30 ppm observadas también en el espectro mostrado en el apéndice AC.
Las señales que corresponden a los metilos del grupo dimetilamino sufren un desplazamiento a campo alto en comparación con el compuesto inicial.
En base a las observaciones realizadas, tanto al espectro de resonancia como al espectro de masas, se propone la siguiente molécula como posible estructura para el fotoproducto aislado.
S O
N
Figura 4.7 Estructura molecular propuesta para el fotoproducto aislado.
La estructura mostrada en la figura 4.7 corresponde con la estructura molecular del compuesto 3-[4-dimetilamino)bencil]-4H-tiocroman-4-ona el cual constituye el producto de un posible rearreglo sigmatrópico de tipo [1,3] sobre el compuesto inicial. Este tipo de rearreglo ocurre preferiblemente vía reacción fotoquímica. La molécula no presenta antecedentes en la literatura por lo que se plantea como un compuesto nuevo.
El rearreglo sigmatrópico propuesto se encuentra acorde con el centro de reactividad identificado en la figura 4.6 y el mecanismo que se plantea para la formación del fotoproducto propuesto51 consiste en la formación de un estado de transición cíclico como se muestra en la figura 4.8.
Figura 4.8 Mecanismo propuesto para la generación del fotoproducto 6C. 52
En la tabla 4.1 se muestran las señales del espectro 1H-RMN para el fotoproducto 6.
Tabla 4.1 Señales del fotoproducto aislado en 1H-RMN.
G
Asignación Integral Desplazamiento (ppm) Multiplicidad
A 7,20 (6 H) 2,91 Singlete dimetilamino se explica en base a la migración del doble enlace que interrumpe la conjugación de los anillos produciendo así dos cromóforos independientes. Esta interrupción en la conjugación aísla el grupo dimetilamino que no pue de conjugar con el grupo carbonilo que inicialmente participaba en el sistema π del cromóforo.
El protón vinílico que antes aparecía en la zona aromática, ahora se desplaza a campo alto.
Esto se debe a que en el compuesto inicial el protón se encuentra fuertemente influenciado por la
acción electroatractora del grupo carbonilo, mientras que en la nueva estructura, el protón vinílico se halla en posición α al átomo de azufre.
Los cuatro protones que no se observan en el espectro aparecen cerca de la zona en la cual aparece la señal del solvente (CDCl3). Por esto se piensa que las señales faltantes están solapadas con la señal del solvente.
Analizadas las evidencias experimentales, sólo resta justificar el por qué la aparición de dos singletes, los cuáles fueron asignados al grupo metileno ubicado entre los dos anillos aromáticos confiriendo a los protones correspondientes un carácter proquiral. La justificación por la cual estos protones no presentan el mismo desplazamiento cuando aparentemente están bajo el mismo ambiente químico, se logra mediante el análisis de la conformación tridimensional de la molécula propuesta.
La figura 4.8 muestra la estructura tridimensional del compuesto 1 donde se observan los protones del grupo metileno sometidos al mismo ambiente químico. La flexión del anillo que posee el átomo de azufre genera condiciones idénticas para ambos protones en cuanto al entorno químico en el que se encuentran.
Figura 4.9 Estructura tridimensional del compuesto 1.
Por otro lado, en la figura 4.9 se muestra la estructura tridimensional de la estructura planteada para el fotoproducto caracterizado. Tras el análisis de la estructura molecular, observamos que el nuevo carbono de hibridización sp3 le confiere un grado de libertad adicional a la molécula. Este grado de libertad consiste en la rotación del enlace sencillo para generar isómeros conformacionales. La estructura del compuesto 1 no l ogra este tipo de movimientos porque el grupo metileno es parte del anillo que contiene al átomo de azufre.
Figura 4.10 Estructura tridimensional del fotoproducto propuesto. Confórmero 1
La figura 4.9 que corresponde al confórmero 1, aparentemente muestra, para el grupo metileno, dos protones equivalentes cuya señal en resonancia magnética debe corresponder a un singlete. Sin embargo, también se observa como ambos anillos se encuentran casi en el mismo plano, además de encontrarse muy próximos. Esta configuración resulta inestable en comparación con la variedad de conformaciones que puede tener la molécula, precisamente por las repulsiones electrónicas que se puedan generar entre ambos anillos.
La posibilidad que tiene la molécula para generar nuevos isómeros conformacionales permite estabilizar la estructura mostrada en la figura anterior mediante la rotación del enlace sencillo para generar, entre otros, el confórmero 2 (Figura 4.10) que se piensa, es más estable
gracias a la disposición de los anillos, los cuáles logran estar más alejados entres sí, brindándole mayor estabilidad a esta conformación en comparación con la anterior.
Como producto de esta rotación se tienen dos protones que, esta vez, tienen orientaciones distintas al confórmero 1 y dejan de encontrarse bajo el mismo ambiente químico.
Figura 4.11 Estructura tridimensional del fotoproducto propuesto. Confórmero 2
En base a esto se plantea un equilibrio conformacional desplazado hacia la estructura mostrada en la figura 4.11, con lo que se plantea que la molécula se encuentra la mayor parte del tiempo bajo la configuración observada en la figura 4.11.
Acorde al confórmero más estable, es posible que los protones proquirales del grupo metileno logren diferenciarse y aparecer en el espectro con desplazamientos distintos.
Es importante señalar que la detección de este fotoproducto, obtenido bajo atmósfera enriquecida con nitrógeno no es excluyente de su posible formación bajo atmósfera de oxígeno.
La complejidad de la mezcla bajo atmósfera de oxígeno evidencia la participación de procesos fotodinámicos en la fotodegradación del compuesto 1 bajo condiciones aeróbicas.
4.6 Ensayo de detección de especies oxidantes.
De acuerdo a los resultados obtenidos tras la realización de este experimento, se concluye que hay generación de especies oxidantes durante la fotólisis del compuesto 1. L a coloración marrón evidenciada durante la reacción de la mezcla de fotoproductos con la solución de yoduro de potasio es indicativo de un posible proceso de reducción de ion yoduro a yodo molecular, el cual exhibe una coloración marrón.
4.7 Hemólisis fotoinducida.
De acuerdo a la curva de fotohemólisis que corresponde al tratamiento de los eritrocitos humanos con 8-metoxi psoralesno, se observó un porcentaje máximo de hemólisis de alrededor de 50 %. La celda control mantuvo su valor de densidad óptica por lo que se comprueba que, solo desde el estado excitado, el 8-metoxi psoraleno logra desencadenar reacciones de ruptura celular sobre los eritrocitos.
Por su parte, el compuesto 1 no m ostró un efecto de hemólisis importante. Se obtuvo un 10 % de hemólisis como porcentaje final. Se concluye que el compuesto 1 no es capaz de generar especies citotóxicas para la generación de ruptura celular de eritrocitos humanos, al menos antes de los 125 m inutos de irradiación. Al igual que el psoraleno, el sistema en la oscuridad no muestra cambios importantes en la densidad óptica.