No existió diferencia estadísticamente significativa entre los recuentos del -SP- con los obtenidos en –SSI- (p>0.05) por lo cual la eliminación de los sustratos que no resultaron significativos sobre la multiplicación de la cepa fue posible, y por consiguiente se descarta cualquier tipo de interacción influyente sobre la promoción del crecimiento celular. Sin embargo, estos datos son insuficientes para descartar otro tipo de relación, sumado a esto, el diseño estadístico utilizado en el –SP- fue de resolución III luego no permite establecer si existió interacción entre factores (Montgomery, 2005). Se realizó un Diseño Factorial Fraccionado –DFF- utilizando las mismas concentraciones de las fuentes que se usaron en el –SP- (Tab. 6, Tab. 14).
Tabla 14 Diseño factorial fraccionado y resultados con niveles factor. Factores codificados2 Corrida C1 C3 N1 N2 S Valor observado 1 CVE1 Valor predicho1 CVP1 1 -1 +1 -1 -1 -1 2,50E+09 37,118% -1,22E+10 32,035% 2 +1 -1 +1 -1 -1 2,79E+10 36,005% 4,29E+10 9,118% 3 +1 +1 -1 +1 -1 2,56E+09 58,816% 1,73E+10 22,662% 4 -1 +1 +1 -1 +1 1,20E+10 1,589% 2,68E+10 14,592% 5 +1 +1 +1 +1 +1 7,11E+10 2,989% 5,63E+10 6,950% 6 -1 -1 -1 +1 +1 3,27E+10 86,516% 4,77E+10 8,203% 7 +1 -1 -1 -1 +1 3,62E+10 79,224% 2,12E+10 18,446% 8 -1 -1 +1 +1 -1 8,44E+10 61,792% 6,94E+10 5,638%
1Resultado de tres mediciones. 2En g/L las concentraciones ajustadas fueron: C1 nivel alto (+)= 5,67, nivel
bajo (-)= 1,89; C3 nivel alto (+)= 4,44, nivel bajo (-)= 1,48; N1 nivel alto (+)= 0,43, nivel bajo (-)= 0,18; N2 nivel alto (+)= 0,47, nivel bajo (-)= 0,20; S nivel alto (+)= 0,50, nivel bajo (-)= 0,10.
Mediante la aplicación del análisis de regresión se generó la siguiente ecuación lineal (Ec. 8): 3,36842 10 - 1,16533 10* 3 7, 71667 8* 1 1,51742 10* 1 1, 40092 10* 2 4,32833 9* Y E E C E C E N E N E S = + + + + + + + + + + (8)
Puesto que el valor del estadístico R-cuadrado es 0.594 se puede asegurar que el modelo explica casi un 60% la variabilidad de la concentración celular. Los resultados obtenidos muestran que el glutamato y el extracto de levadura presentan una influencia estadísticamente significativa (p<0.05) sobre el crecimiento de la cepa C50 de Rhizobium sp. cuando la fuente se aplica en el nivel superior (Tab. 15). Estos datos
contrastan con los previamente obtenidos donde ambas fuentes no habían resultado influyentes sobre la producción de biomasa. Esto se pudo deber, a que existió algún tipo de interacción entre los componentes del medio de cultivo, de tal manera que los sustratos que resultaban más influyentes sobre la multiplicación quizá no se encontraban disponibles o no fueron metabolizadas porque existían fuentes mas fácilmente asimilables pero con menor contenido nutricional. En éste caso particular, es posible que la bacteria haya disminuido la actividad de las enzimas necesarias para el metabolismo de las otras fuentes de nitrógeno -extractos y glutamato- ya que en el medio de cultivo líquido había iones amonio provenientes de la sal nitrogenada usada, los cuales son asimilados con mayor facilidad. En general, el amonio es la fuente de nitrógeno preferida en bacterias Gram-negativas, para la asimilación de ésta, en primer lugar se da la incorporación a través de la membrana vía transporte activo o difusión simple y luego la incorporación a formas orgánicas, principalmente glutamato y glutamina (Pedrosa y Elmerich, 2007). Posiblemente se haya dado una situación similar con el extracto de levadura, no obstante, éste no sólo actúa como fuente de nitrógeno, sino también como fuente de cofactores enzimáticos (Takahashi et al., 2006; Edens et al., 2002). En el caso del screening secundario, el glutamato resultó tener una actividad significativa, lo cual se puede deber a que este no funciona únicamente como fuente de nitrógeno sino que tanto él como su esqueleto carbonado –α-cetoglutarato- también
pueden actuar como fuentes de carbono o como intermediarios para el catabolismo o la síntesis de otras moléculas nitrogenadas como aminoácidos, purinas o pirimidinas (KEGG, 2008; Matheus et al., 2003).
Tabla 15 Efectos y análisis de variables por método estadístico.
Fuente GL Efecto estimado Suma de cuadrados Radio – F P
C1 1 1,54E+9 1,42E+19 0,02 0,8998 C3 1 -23,3E+9 3,26E+21 3,73 0,0713b N1 1 30,3E+9 5,52E+21 6,32 0,0230a N2 1 28,0E+9 4,71E+21 5,39 0,0338a S 1 8,65E+9 4,49E+20 0,51 0,8722 a
Variables que tuvieron un efecto significativo sobre la multiplicación de la cepa. Confianza 95%. bEfecto significativo. Confianza 92.5%.
En el caso de las fuentes de carbono estas nuevamente no resultaron significativas sobre el crecimiento de la cepa (p>0.05). Sin embargo, los resultados muestran que la melaza también influye sobre el crecimiento de la cepa, y además éste factor resulta significativo cuando el error es 0.075 (Tab. 15). Generalmente, este tipo de residuos de la caña suelen tener alto contenido de hidratos de carbono los cuales representan una fuente de carbono importante para el crecimiento celular, casi 75%, de sales (Mn, Cu, Fe, Ca, K, Mg, Se) y además de vitaminas como la piridoxina que pueden ser empleadas como cofactores en la síntesis de otros biocompuestos de interés celular. Las principales vías para el metabolismo de carbohidratos en Rhizobium sp. son la Entner Doudoroff y la vía de las pentosas fosfato debido a que las enzimas fructosa-1,6 difosfato aldolasa y la 6-fosfofructoquinasa, fundamentales en la vía Embden- Meyerhof Parnas, tienen baja actividad (Kuykendall et al., 2005). El glicerol resultó ser el sustrato con menor influencia sobre el crecimiento de la cepa C50 de Rhizobium. Las sales también presentaron baja influencia sobre el crecimiento de la cepa, sin embargo en el screening primario habían resultado ser las más influyentes, esto se pudo deber a alguna interacción entre éstas y los componentes que fueron excluidos en el –SP-. 5.2. Screening secundario II – SSII-.
Se modificaron las concentraciones de glutamato y de extracto de levadura, sin embargo, también se trabajó con la melaza ya que resultó ser la tercera fuente más importante en la multiplicación, la variación de las concentraciones fue hecha de acuerdo con el valor del efecto estimado (Tab. 15). A diferencia del paso de –SP- a – SSI- donde se removieron tres de las ocho fuentes presentes, en el paso de –SSI- a - SSII- se mantuvo constante el número de sustratos (Tab. 16). La concentración de sales y glicerol se mantuvo en el nivel inferior, debido a la significancia estadística que mostraron en –SSI- (Tab. 15), el criterio de decisión usado fue el costo económico. Los niveles en g/L se ajustaron así: C3 nivel alto (+)= 2.96, nivel bajo (-)= 1.48; N1 nivel alto (+)= 0.66, nivel bajo (-)= 0.42; N2 nivel alto (+)= 0.73, nivel bajo (-)= 0.46. Tabla 16 Diseño Factorial Fraccionado saturado de ½ y un punto central, y resultados con niveles factor.
Factores codificados2
Corrida
C3 N1 N2
Valor
observado1,3 CVE3 predichoValor 1,3 CVP1,3
2 +1 +1 +1 1,99E+10 43,710% 1,90E+10 63,919%
3 0 0 0 4,22E+10 89,458% 4,58E+10 26,567%
4 +1 -1 -1 2,78E+10 54,343% 2,69E+10 45,292%
5 -1 -1 +1 3,34E+10 100,635% 3,25E+10 37,470%
1Resultado de tres mediciones. 2En g/L: C1 = 1.89 y S= 0.10 se dejaron constantes.
Mediante la aplicación del análisis de regresión se generó la siguiente ecuación lineal (Ec. 9): 4,58267 10 - 2, 28833 10* 3 1,615 10* 1 - 2, 00667 10* 2 Y E E C E N E N = + + + + + (9)
Puesto que el valor del estadístico R-cuadrado es 0,751 se puede asegurar que el modelo explica en un 75% la variabilidad de la concentración celular. Existió evidencia estadísticamente significativa que demuestra que los tres factores influyeron sobre el crecimiento de la cepa C50 (p<0.05), la melaza y la levadura generaron un efecto negativo y el glutamato efecto positivo (Tab. 17).
Tabla 17 Efectos y análisis de variables por método estadístico.
Fuente GL Efecto estimado Suma de cuadrados Radio – F P
C3 1 -4,57E+10 6,28E21 10,85 0.0093a
N1 1 3,23E+10 3,12E21 5,40 0.0452a
N2 1 -4,01E+10 4,83E21 8,34 0.0179a
aVariables que tuvieron efecto significativo sobre la multiplicación de la cepa. Confianza 95%.
La melaza continuó teniendo efecto negativo sobre el crecimiento celular, sin embargo, en esta ocasión su efecto fue estadísticamente significativo lo cual obliga a continuar disminuyendo la concentración de este factor y así provocar una mejor disposición de sustratos de tal manera que se favorezca la multiplicación de las células (p<0.05). Sobre la levadura, se había hecho un incremento de la concentración de acuerdo con los resultados obtenidos en –SSI-, no obstante, este aumento mostró no ser positivo y por el contrario generó un efecto negativo sobre la bacteria, luego es necesario ajustar los niveles con el objeto de mejorar la respuesta (p<0.05). Éste efecto negativo se pudo deber a que las altas concentraciones de extracto de levadura causan una alteración de la morfología celular en algunas cepas de rizobios, así que es posible que la
concentración alta dispuesta en el diseño experimental haya superado el límite de tolerancia de C50, lo cual provocó distorsión en las células, y por consiguiente una disminución en la viabilidad celular dentro del medio de cultivo, esto se puede afirmar, ya que estudios demuestran que existe una relación intima entre estas variables (Skinner et al., 1977). La concentración de glutamato siguió camino ascendente puesto que su efecto es significativo cuando la fuente se aplica en el nivel superior (p<0.05).