Secuenciación de los 10 exones del gen RHD

Los estudios de secuenciación fueron realizados en las 25 muestras D-/RHD+ no identificadas por microarreglos de ADN y en 5 muestras pendientes de caracterización seleccionadas al azar (ítem 1.3.3.3.2. de Materiales y Métodos). Los resultados obtenidos para una de las muestras con fenotipo Ccee mostraron la presencia de una duplicación de 37 pb característica del alelo RHDψ,

además de las mutaciones propias de dicha variante: c.609 G>A, c.654G>C, c.667T>G, c.674C>T y

c.807T>G.

En la Figura 21 se muestra un fragmento del cromatograma obtenido de la secuenciación de la región del intrón 3/exón 4 de la muestra portadora del alelo RHDψ donde se observa la duplicación de 37 pb y de una muestra RHD normal.

Figura 21. Cromatograma correspondiente a la región del intrón 3/exón 4 de la muestra portadora del alelo RHDψ y de una muestra RHD normal, respectivamente. Los rectángulos color fucsia representan los 37 pb que se encuentran duplicados en la variante alélica RHDψ.Los rectángulos color amarillo señalan la secuencia del exón 4 contigua a la región duplicada.

En la Figura 22 se observan fragmentos del cromatograma obtenido en los estudios de secuenciación de la muestra portadora del alelo RHDψ y de una muestra con un alelo RHD

normal, donde se indican las mutaciones puntuales correspondientes a las reportadas para esta variante.

Exón 4 c.609 G>A

Exón 5 c.654 G>C c.667 T>G c.674 C>T

Exón 6 c.807T>G

Figura 22. Fragmentos del cromatograma correspondiente a los exones 4, 5 y 6 del alelo RHDψ y de un alelo RHD

normal. En la figura se muestran fragmentos de cromatogramas conteniendo los 5 SNPs en los exones 4, 5 y 6 del gen RHD, característicos de la variante alélica RHDψ.

Por otro lado, se identificó una nueva variante del gen RHD en 8 muestras D-/RHD+ con fenotipo ccEe. Este nuevo alelo se caracteriza por la inserción de una G entre los nucleótidos 581 y 582 del exón 4 del gen RHD. Este polimorfismo provoca un desplazamiento en el marco de lectura y la formación de un codón de terminación prematuro en la posición 198 del ARNm y la generación de una proteína RhD de 197 residuos de aminoácidos. Esta nueva variante alélica fue

RHDΨ RHD normal RHDΨ RHD normal RHDΨ RHD normal

registrada en GenBank (Accession Number KU899995), la base de datos de secuencias genéticas del NIH (National Institutes of Health de Estados Unidos), y se denominó RHD*581insG. En la Figura 23 se muestra un fragmento del cromatograma obtenido en los estudios de secuenciación del exón 4 de una muestra portadora del alelo RHD*581insG y de una muestra RHD normal.

Figura 23. Cromatograma correspondiente al exón 4 de un alelo RHD normal y de la variante RHD*581insG. En la parte superior de la figura se muestra un fragmento del exón 4 del alelo RHD normal. En la parte inferior del gráfico se muestra el cromatograma obtenido para el alelo RHD*581insG y subrayado se señala el codón de terminación prematuro generado. La flecha indica la inserción nucleotídica de una G entre los nucleótidos 581 y 582 del gen

RHD.

Además, en 7 muestras con fenotipo D negativo y expresión del antígeno E se identificó el polimorfismo 46C en el exón 1 del gen RHD. Este cambio nucleotídico conduce a la sustitución de la T presente en la posición 46 por una C. En la Figura 24 se muestra un fragmento del cromatograma obtenido de la secuenciación del exón 1 del gen RHD en una muestra portadora del alelo denominado RHD*46C y en una muestra RHD normal. Este SNP genera el cambio aminoacídico p.Trp16Arg.

RHD normal

RHD*581insG

Figura 24. Cromatograma correspondiente al exón 1 de un alelo RHD normal y del alelo RHD*46C. En la parte superior de la figura se muestra una fracción de la secuencia del exón 1 de un alelo RHD normal y en la parte inferior el correspondiente al alelo RHD*46C. Las flechas rojas indican el cambio nucleotídico en la posición 46 del gen RHD.

Los análisis de secuenciación permitieron también identificar un nuevo polimorfismo no reportado anteriormente en una muestra con expresión del antígeno E. Los resultados obtenidos mostraron la presencia de la mutación puntual sin sentido c.1001T>A en el exón 7 del gen RHD. Esta nueva variante alélica es responsable de la generación de un codón de terminación prematuro en la posición 344 del ARNm, produciéndose una proteína RhD truncada.

Por otro lado, los estudios de secuenciación también permitieron detectar el alelo

RHD*1248insG. La inserción de una G entre las posiciones 1247 y 1248 del gen RHD provoca la eliminación del codón de finalización de la traducción de la proteína RhD y la generación de un nuevo codón de terminación corriente arriba en la posición 489 del ARNm. La nueva variante alélica origina una proteína de 488 residuos aminoacídicos. En la siguiente figura se observa un fragmento del cromatograma obtenido de la secuenciación del exón 10 del gen RHD en una muestra portadora de este alelo, denominado RHD*1248insG y en una muestra RHD normal.

RHD normal

Figura 25. Cromatograma correspondiente al exón 10 de un alelo RHD normal y del alelo RHD*1258insG. En la parte superior de la figura se muestra una fracción de la secuencia del exón 10 de un alelo RHD normal y en la parte inferior el correspondiente al alelo RHD*1248insG. La flecha indica la inserción nucleotídica de una G entre los nucleótidos 1247 y 1248 del gen RHD.

Debido a que las variantes alélicas RHD(IVS3+1g>a), RHD*581insG, RHD*M295I y RHD*46C

fueron halladas en más de dos muestras con fenotipo D negativo, se desarrollaron estrategias de PCR alelo específicas y PCR RFLP (ítem 1.3.3.5. de la sección Materiales y Métodos) para investigar la presencia de dichos alelos en las 35 muestras pendientes de caracterización. Estas estrategias permitieron identificar 5 muestras portadoras de la variante alélica RHD*46C y 11 con el alelo RHD*581insG. Además, utilizando la estrategia de PCR RFLP se caracterizaron 2 muestras portadoras del alelo RHD*M295I.

Posteriormente, las 16 muestras no caracterizadas fueron secuenciadas y no se hallaron mutaciones en las secuencias nucleotídicas codificantes ni en las regiones de unión exón-intrón.

2.2.5. Otros estudios moleculares