Selección de candidatos vacunales proteicos

Lidia Gómez Gascón      ENSAYOS EXPERIMENTALES. OBJETIVO 1

Para la obtención de las proteínas recombinantes, expresamos un

fragmento de la proteína SsnA  (surface-anchored DNA nuclease), codificada

por el ORF SSU1760 en la secuencia de la cepa P1/7 de S. suis, que abarca los aminoácidos G36-L352, y un fragmento de la proteína OppA (oligopeptide- binding protein OppA precursor), codificada por el ORF SSU1664, que abarca los aminoácidos S281-E596. Los fragmentos de ADN correspondientes se amplificaron por PCR a partir de ADN genómico de la cepa de S. suis P1/7. Por otra parte, los fragmentos de las proteínas recombinantes se produjeron como polipéptidos fusionados a la glutatión S-transferasa (GST) en Escherichia coli DH5α con el vector pRGSTENT (Biomedal), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos recombinantes se expresaron después de la inducción con IPTG en E. coli BL21, y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con una columna de GSH, comprobando que la pureza era superior al 95%. Las identificaciones de las proteínas se confirmaron mediante análisis MALDI-TOF/MS.

C.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Para la detección de los genes que codifican cada una de las proteínas, se extrajo el ADN genómico de cada aislamiento. Los cebadores diseñados para la detección de los genes de la SsnA y de la OppA se muestran en la Tabla 2.2. El protocolo de PCR fue 5 min a 94 ºC, seguido por 30 ciclos de 1 min a 94 ºC, 90 s a 56 ºC y 1 min a 72 ºC. Los productos resultantes se visualizaron en un gel de agarosa al 1% y fueron de 913 pb para SsnA y 955 pb para OppA.

Tabla 2.2. Cebadores diseñados para las proteínas OppA y SsnA

Proteína Forward Reverse

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SsnA 5' TATCGGATTGATTGAAGTGCAG 3' 5' TGTTGGCTTGTTATTGTTGGTC 3'

C.3. Producción de suero hiperinmune anti-SsnA y anti-OppA en conejos.

Se utilizaron dos conejos New Zealand para la obtención de los sueros hiperinmunes frente a las dos proteínas recombinantes obtenidas, mediante un protocolo basado en 6 inmunizaciones. La primera consistió en una inyección subcutánea de la proteína recombinante rSsnA o rOppA (250 µg) mezclada con el adyuvante completo de Freund en el día 0. Las demás inmunizaciones se realizaron los días 14, 28, 35, 57 y 64 por vía intramuscular (125 µg de proteína) con adyuvante incompleto y completo de Freund alternativamente. El suero preinmune de los conejos se recogió antes de la primera inyección, y se utilizó como control negativo.

C.4. Infección experimental de ratones.

Para demostrar el carácter inmunógeno de ambas proteínas, seis ratones hembras de la estirpe CD1 (Charles River Laboratories, Francia), de 4 semanas de edad, se dividieron en dos jaulas aleatoriamente, con tres animales por grupo. Los animales se aclimataron a unas condiciones de 12 horas luz/12 horas oscuridad, y se mantuvieron con comida y agua ad libitum. Los animales del grupo 1 fueron infectados con 1mL de una suspensión de S. suis (ref.

235/02, cps2, mrp+ef+sly+) que contenía 2 × 106 _{ufc/mL en PBS y los}

animales del grupo 2 fueron inoculados con 1mL de PBS. Una vez transcurridos treinta días tras la infección, los animales fueron sacrificados y se obtuvo la sangre por punción cardíaca en tubos con sistema de vacío BD Vacutainer® sin anticoagulante para recoger el suero. Las infecciones se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Unión Europea para el

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manejo de animales de laboratorio y fueron aprobadas por el Comité de Ética de la Universidad de Córdoba (Ref. número 5177).

C.5. Análisis de inmunofluorescencia por citometría de flujo.

Para demostrar la expresión en superficie de las proteínas seleccionadas, las distintas cepas de S. suis se sembraron en caldo Todd-Hewitt (THB) y se dejaron incubar hasta la mitad de la fase exponencial, se recogieron

por centrifugación y se diluyeron hasta una concentración de 107 _{células/mL. A}

continuación, se lavaron dos veces con PBS y se bloquearon durante 30 min a 20 ºC con 100 µL de PBS que contenía 10% de suero fetal bovino (PBS-FCS). Los tubos se lavaron dos veces con tampón de lavado que contenía PBS con albúmina sérica bovina al 1% (BSA).

Los antisueros de conejo frente a la SsnA y a la OppA se diluyeron (1:200) en PBS-BSA y se incubaron con las bacterias durante 30 min a 4 ºC. Posteriormente, se incubaron con anti-IgG de conejo de cabra conjugado con ficoeritrina (Invitrogen), diluido 1:50, a 4 ºC en oscuridad durante 30 min. Las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en PBS que contenía un 4% de paraformaldehído. Finalmente, se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson), utilizando el software FlowJo (Tree Star, Inc., EE.UU.) para el estudio de los datos. Se consideraron positivas aquellas muestras que daban una fluorescencia mayor de 2. Se estima que el valor de 2 representa el umbral por encima del cual no hay prácticamente solapamiento (o es menor del 5%) entre las dos poblaciones de células (suero inmune y preinmune) para las que se hace el ensayo.

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Se realizó el Western blot para poner en evidencia la expresión de la proteína OppA. Todas las cepas de S. suis utilizadas en este trabajo fueron sometidas a un tratamiento con mutanolisina toda la noche a 37 ºC, se sonicaron (6 ciclos de 20 segundos a media potencia) y centrifugaron. A continuación, 30 µL del sobrenadante del extracto total fue separado mediante electroforesis SDS-PAGE (Electroforesis en Gel de Poliacrilamida con Dodecil Sulfato Sódico) al 12%. Posteriormente, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa durante 20 minutos a 15 V, utilizando un sistema

de transferencia semiseca (Amersham Pharmacia Biotech). Luego se incubaron

durante 1 hora a 37 ºC con el suero hiperinmune anti-OppA a una dilución 1/5000. Para revelar la reacción se utilizó suero anti-IgG de cabra frente a conejo, conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) (1/2500) y se revelaron con el kit ECL Plus Western Blotting Detection System (GE Healthcare), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

C.7. Técnica ELISA para valoración de anticuerpos en suero

Se utilizó una técnica de Ensayo Inmunoenzimático (ELISA) indirecto, de fabricación propia, para valorar el título de anticuerpos generado frente a ambas proteínas. Las placas de microtitulación se tapizaron con 0,5 mg/mL de

rSsnA u rOppA en tampón de tapizado (0,05 M de NaHCO3, pH 9,6) y se

incubaron a 4 ºC durante toda la noche. Después de lavar tres veces con PBS- 0,05% de Tween-20, las placas se bloquearon con 100 µL de BSA al 2% durante 1 h a 37 ºC, y se lavaron de nuevo tres veces. Posteriormente, se incubaron con los sueros problema diluidos (diluciones dobles seriadas) durante 40 min a 37 ºC. Para revelar la reacción, cada pocillo se incubó con

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Inmunoglobulinas G (IgG) anti-conejo o anti-ratón unidas a HRP (Sigma- Aldrich), diluida 1:5.000 en tampón de lavado durante 40 min a 37 ºC.

Las placas se lavaron tres veces y la reacción se reveló mediante la adición de 100 µL de la solución sustrato 3,3'5,5' tetrametil-bencidina (sustrato TMB, Sigma-Aldrich) en oscuridad durante 20 min. La reacción se detuvo añadiendo 100 µL de solución de parada (Sigma-Aldrich) y por último, medimos la absorbancia a 450 nm en un lector de ELISA (BIO-RAD). Se

consideraron positivos todos aquellos sueros que dieron una DO450 mayor a la

del control negativo por dos veces su desviación estándar.