SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS 1 MATERIAL Y MÉTODOS

Como ya se ha mencionado anteriormente, las especies de Halomonas incluidas en el presente trabajo fueron aquéllas que en el momento de iniciarse el estudio eran descritas como desnitrificantes en su referencia original. Se recogen en la Tabla 7.

Tabla 7. Especies de Halomonas válidamente publicadas y descritas como desnitrificantes.

Aparte de ellas, y tal y como se ha señalado en los objetivos, hemos incluido otras cepas

procedentes de nuestra colección de cultivo (Martinez-Canovas, M.J. 2002; Ruiz-Garcia, 2003),

beneficiada en los últimos años también con microorganismos cedidos por los Dres. Dimitri Sorokin de la TU Delft (Holanda) y Bernardo Prado, de la Universidad Federico Sta. María (Chile). Asimismo, los criterios aplicados para esta selección se hicieron extensibles a Halomonas

alimentaria (Yoon y col., 2002), la única especie por entonces del género Halomonas que había

quedado fuera del estudio fenotípico realizado por Mata y col. (2002), y en cuya descripción original se mencionaba su capacidad para crecer en anaerobiosis pero no bajo qué condiciones (respiración, y en su caso tipo de aceptor alternativo al oxígeno, o fermentación).

Especie Origen Referencia

H. campisalis

ATCC 700597T Sedimento de Alkali Lake (Washington, USA) Mormile y col., 1999 H. desiderata

DSM 9502T Planta de tratamiento de aguas residuales _{(Gottingen, Alemania)} Berendes, 1996 H. halodenitrificans

ATCC 13511T Salmueras de curación de carnes Robinson y Gibbons,1952: Dobson _{y Franzmann, 1996} H. ventosae

III.1.1. Criterios de inclusión de cepas procedentes de nuestra colección de cultivo

La selección de las cepas desnitrificantes se basó en la positividad del test diseñado por Callies y Mannheim (1978) que se modificó según Stanier y col. (1966). El resultado positivo viene dado por el crecimiento con nitrato y nitrito como aceptores finales de electrones y por la producción de gas (Figura 12). También se incluyeron en los estudios posteriores aquellas cepas que sólo respiraban sobre nitrato aunque no llevaran a cabo los siguientes pasos de un proceso de desnitrificación completo; esta capacidad se vería reflejada en la prueba por crecimiento sin producción de gas.

Figura 12. Resultado positivo y negativos en la prueba de respiración sobre nitratos/nitritos

El medio de cultivo base se distribuyó en tubos Weimberg. Se ajustó el pH a 7-7,2 y se esterilizó en autoclave a 112ºC durante 30 minutos. Su composición se detalla en el cuadro de la página siguiente.

Prueba de respiración sobre nitratos y nitritos

(Stanier y col., 1966)

a. _{La concentración salina se ajustó a partir de un stock al 30% (p/v),}

conocido como Sales de Subow (Rodríguez-Valera y col., 1981), con la misma proporción de sales que el agua de mar. Véase apartado III.1.2.

El preinóculo se realizó en el medio descrito anteriormente, adicionado del mismo porcentaje de nitrato o nitrito -dependiendo de la prueba-. Siguiendo las recomendaciones de Stanier y col. (1966), la incubación del preinóculo se hizo en aerobiosis pero sin agitación, ya que ésta favorece la difusión del oxígeno en el medio y, podría, por tanto, reprimir la síntesis de alguna de las enzimas desnitrificantes (Cavigelli y Robertson, 2000).

Tras _{24 horas se tomó una muestra con una pipeta Pasteur estéril y se inoculó el fondo de}

un tubo Weimberg previamente regenerado (15 minutos a ebullición y enfriamiento rápido en hielo). Procediendo con rapidez, se selló el tubo con agar estéril al 2% (p/v) a sobrefusión, formando un tapón de unos dos centímetros; finalmente se añadió parafina, también estéril.

Los tubos se incubaron a 32ºC durante 15 días, efectuándose lecturas diarias para detectar si existía crecimiento sin producción de ácidos, lo que indicaba que se había producido una respiración. Asimismo, se anotó la existencia de gases, observada por el desplazamiento del tapón de agar.

Por otra parte, las cepas seleccionadas mediante el criterio anterior se sometieron a una segunda criba para escoger aquéllas que presentaran semejanza con el género Halomonas y otros relacionados. Se realizó una batería de pruebas fenotípicas básicas (tinción de Gram, tipo de

Glicerol (Panreac®_{)... 1,0g} Extracto de levadura (Difco®_{)... 0,3g} Proteosa-peptona nº3 (Difco®_{)... 0,5g} Nitrato potásico (Merck®_{)... 1g} (nitrito potásico -Merck®_{-, en su caso)... 0,01g} Rojo fenol al 0,04% (p/v) (sol. acuosa)... 2,0 ml Solución de salesa _{al 7,5% (p/v) c.s.p... 100ml}

metabolismo, crecimiento óptimo de temperatura, pH y concentración de sales), descritas con todo detalle en el apartado IV.1. A..1. de esta memoria.

III.1.2. Conservación de los microorganismos

La conservación de las cepas para uso cotidiano se hizo a una temperatura de 20ºC en medio sólido MY (Moraine y Rogovin, 1966; Quesada y col., 1993) al 7,5% (p/v) de sales (Rodríguez-Valera y col., 1981). El pH se ajustó a 7-7,2, salvo cuando el medio iba destinado a la conservación de Halomonas campisalis y H. desiderata, con los cuales el pH se elevó a 8-8,5. La descripción del medio MY, así como la de la mezcla de sales se describe en los cuadros inferiores.

Medio MY modificado Sales de Subow al 30% (p/v) (Moraine y Rogovin, 1966; Quesada y col., 1993) (Rodríguez-Valera y col., 1981)

Para la conservación a largo plazo, los microorganismos en cultivos líquidos del mismo medio se mantuvieron congelados a -80ºC. Como crioprotector se empleó dimetil sulfóxido a una concentración del 20% (v/v). NaCl (Panreac®_{)... 234,0 g} MgCl2⋅6H2O (Merck®_{)... 41,6g} MgSO4⋅7H2O (Merck®_{)... 59,8g} CaCl2⋅2H2O (Merck®_{)... 1,1g} KCl (Merck®_{)... 6,0g} NaHCO3 (Merck®_{)... 0,2g} NaBr (Merck®_{)... 0,7g} Solución 0,5% (p/v) de FeCl3⋅6H2O 0,65ml H20 destilada c.s.p... 1000ml Glucosa (Panreac®_{)... 1,0g} Extracto de levadura (Difco®_{)... 0,3g} Proteosa-peptona nº3 (Difco®_{)... 0,5g} Extracto de malta (Panreac®_{)... 0,3g} Solución de sales al 7,5% (p/v) c.s.p. 100ml

III.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

III.2.1. Halomonas alimentaria como especie desnitrificante

De acuerdo a los criterios expuestos en el apartado III.1.1. de Material y Métodos,

Halomonas alimentaria (Yoon y col., 2002) puede ser considerada como especie desnitrificante, al

observarse abundante crecimiento en el medio descrito y producción de gases, que desplazaron el tapón de agar. La cepa tipo de dicha especie, DSM 15356T_{, fue aislada de una comida fermentada} de origen marino, tradicional de Corea (Yoon y col., 2002).

III.2.2. Cepas de nuestra colección de cultivo con capacidad desnitrificante

De acuerdo a los criterios descritos en el apartado III.1.1., las cepas seleccionadas por su capacidad desnitrificante para los estudios posteriores fueron las que a continuación se indican en la Tabla 8:

Tabla 8. Nombre y procedencia de las cepas de nuestra colección de cultivo, seleccionadas por su capacidad desnitrificante.

Cepa Procedencia

11S Salina solar en Montemar (Viña del Mar, Chile)

4CR Suelo hipersalino de Fuente de Piedra (Málaga, España)

5CR “

15CR “

Al13 Barranco de la salina (Jaén, España)

C8 Sedimentos de salinas solares de Cahuil (Chile) (Figura 15)

F15 Suelo hipersalino de Fuente de Piedra (Málaga, España)

HGD1 Lago haloalcalino en la estepa de Altai (Siberia, Rusia)

HGDK1 Lago haloalcalino en la estepa de Altai (Siberia, Rusia)

N64 Salinas del Sabinar (Almería, España) (Figura 14)

R53 Salinas de Rambla Salada (Murcia, España) (Figura 13)