Selección del Intervalo de Longitudes de Onda de Trabajo

En la Figura III.2.1se muestran los espectros de absorción electrónica de PEF y FEX y de una mezcla de ambos en su relación terapéutica, en la zona de 220 a 275 nm. A simple vista se puede observar que si bien ambos analitos absorben, FEX presenta coeficientes de extinción molar comparativamente muy elevados entre 220 y 230 nm, que producen una

desviación de la ley de Beer insubsanable a valores de absorbancia útiles para la cuantificación de PEF. Aún sin tomar en cuenta el error instrumental inherente a dicha zona del espectro, este detalle se percibió como una importante razón para descartar esa zona del espectro.

Por las mencionadas características de los espectros, se decidió tomar como intervalo de trabajo la zona entre 240 y 275 nm, ya que a longitudes de onda mayores ambos analitos no presentan absorción.

Si bien en esta región los analitos presentan un amplio solapamiento espectral, a priori

se pensó que el problema de cuantificación podría ser resuelto satisfactoriamente mediante la aplicación del algoritmo PLS.

220 230 240 250 260 270 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 H NM e M e O H N H O O H C O2H

C lorhidra to d e F exofe na din a

C lo rh id rato de Ps eud oefed rin a

. H C l . H C l Abso rbancia Longitud de Onda (nm) 1 2 3 4

Figura III.2.1.Espectros de Absorción electrónica de: PEF a 460 mg L−1 (1); FEX a 40,2 mg L−1 (2); FEX a 230 mg L−1 (3) y mezcla de PEF a 460 mg L−1 y FEX a 230 mg L−1 (4) en HCl 0,01 M-MeOH (80:20, v/v), en la región entre 220 y 275 nm.

III.2.3. Diseño del Conjunto de Calibración y Optimización de los Parámetros Estadísticos

Para efectuar la calibración se preparó un conjunto de 16 mezclas de calibración de ambos analitos, cuyas concentraciones fueron seleccionadas siguiendo un diseño factorial

completo a cuatro niveles (42), como se muestra en la Figura III.2.2, y se levantaron sus espectros de absorción electrónica en el intervalo de 240 a 275 nm.

300 350 400 450 500 550 600 150 180 210 240 270 300 FEX (mg L -1 ) PEF (mg L-1)

Figura III.2.2. Representación gráfica de la composición del conjunto de mezclas para la etapa de calibración de la mezcla PEF-FEX.

Para la selección del intervalo óptimo de longitudes de onda de calibración de cada analito, se aplicó el algoritmo de selección de sensores de ventana móvil de ancho variable, empleando el criterio de mínimo PRESS.

Tabla III.2.1. Análisis UV-PLS de mezclas de Clorhidrato de Fexofenadina y Clorhidrato de Pseudoefedrina. Variancia explicada por cada LV.

FEX PEF

Bloque de las X Bloque de las Y Bloque de las X Bloque de las Y

LV Individual Total Individual Total Individual Total Individual Total

1 95,06 95,06 46,43 46,43 96,14 96,14 51,40 51,40 2 4,93 99,99 53,49 99,92 3,85 99,99 48,46 99,86 3 0,00 100,0 0,03 99,96 0,00 100,0 0,05 99,91 4 0,00 100,0 0,02 99,98 0,00 100,0 0,06 99,97 5 0,00 100,0 0,01 99,99 0,00 100,0 0,02 99,99 6 0,000 99,999 0,006 99,998 0,000 99,999 0,007 99,994

Para cada analito, la zona del mínimo error y el número de factores óptimos fueron seleccionados siguiendo el criterio de la prueba F propuesta por Haaland y Thomas, para evitar posibles sobre-ajustes.105

En el caso de FEX, el intervalo elegido fue entre 241 y 274 nm, el cual presentó la mejor selectividad y más adecuada recuperación del analito en las mezclas sintéticas. El número óptimo de factores fue de 2. Como se puede observar en la Tabla III.2.1, la variancia explicada con 2 LVs es superior al 99,9%, lo que deja afuera del modelo un 0,31% (0,10,5 %) de variación aleatoria, lo cual resulta ser ampliamente inferior al ruido instrumental.

Tabla III.2.2. Análisis UV-PLS de mezclas de Clorhidrato de Fexofenadina y Clorhidrato de Pseudoefedrina. Parámetros críticos de la calibración.

Parámetro de interésa FEX PEF

Intervalo espectral (nm) 241 – 274 242 – 258 Intervalo de concentración (mg L-1_{) 160,6 – 301,2 325,6 – 610,5} Número de factores (LVs) 2 3 PRESS[(mg L-1)2] 40 480 RMSD(%) 0,74 0,72 REC (%) 0,67 0,75 r2 0,999 0,999 Selectividad (SEL) 0,37 0,12 Sensibilidad (SEN) 0,0024 0,0003 Sensibilidad analítica (γ, L mg-1) 0,224 0,033

Mínima diferencia de concentración [ mg L-1] 4,47 30,7

Por su parte, para PEF se emplearon 3 factores en el intervalo de 242 a 259 nm, donde la recuperación del analito y los errores del método resultaron minimizados con respecto a la utilización del espectro completo. Mediante un razonamiento análogo se justifica la elección 3 de LVs para analizar PEF.

análisis de los mismos se desprende que el método es apto para los objetivos planteados, ya que sus indicadores de dispersión presentan valores bajos y tanto su sensibilidad y como su selectividad son apropiadas.

III.2.4. Validación del Método Mediante el Uso de Muestras Sintéticas

La exactitud y la precisión del método propuesto también fueron evaluadas con distintos grupos de muestras de validación independientes. Para validar la precisión intermedia en el intervalo de concentraciones de interés se prepararon 3 conjuntos de 9 mezclas sintéticas cada uno, que se analizaron en tres instancias diferentes, con los resultados que se muestran en la Tabla III.2.3.

Tabla III.2.3: Resultados de la recuperación de los analitos de muestras sintéticas.

Analito Clorhidrato de Fexofenadina Clorhidrato de Pseudoefedrina

Día Nº 1 2 3 Media 1 2 3 Media

Recuperación (%) 99,8 98,1 99,1 99,0 99,9 98,4 99,0 99,1

RSD (%)a 0,9 1,9 1,5 1,4 0,9 1,1 1,5 1,2

a _{Se emplearon nueve muestras por día y analito.}

En todos los casos se observó una recuperación de ambos analitos cuantitativa, con baja dispersión entre los resultados, lo cual permitió concluir que el método propuesto es preciso al nivel de su repetibilidad.

La evaluación de los datos individuales de las 27 muestras preparadas por medio de un análisis de la variancia a un factor, cuyos resultados se detallan en la Tabla III.2.4, reveló que tanto para PEF como para FEX no existía diferencia estadística entre los grupos, con un nivel de significación del 5% (α = 0,05), indicando que el método propuesto reunía las características de precisión adecuadas, a nivel de precisión intermedia.

Tabla III.2.4. Cuadro de resultados de la prueva ANOVA a un factor para las recuperaciones porcentuales de los tres grupos de mezclas sintéticas conteniendo FEX y PEF.

Clorhidrato de Fexofenadina Clorhidrato de Pseudoefedrina

Fuente de variación SC GL CM F Fuente de variación SC GL CM F

Entre medias 7,94 2 3,97 1,17 Entre medias 1,59 2 0,80 0,40

Dentro del grupo 81,16 24 3,38 - Dentro del grupo 48,21 24 2,01 -

Total 89,10 26 - - Total 49,80 26 - -

SC: Suma de cuadrados; GL: Grados de libertad; CM: Cuadrado medio de error. F: Cociente F observado; Fcrit (0,05, 2, 24)= 3,40.

Por otra parte, el análisis de las recuperaciones individuales de un conjunto de nueve muestras sintéticas (Tabla III.2.5), permitió evaluar la exactitud del método.

Tabla III. 2.5. Demostración de la exactitud del método.

Muestra Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Media RSD FEX (mg L-1₎ 210,1 243,3 298,6 210,1 243,3 298,6 210,1 243,3 298,6 Recup. (%) 100,2 98,3 98,9 99,5 100,3 100,0 100,1 101,5 99,3 99,8 0,9 PEF (mg L-1₎ 417,4 417,4 417,4 483,0 483,0 483,0 549,2 549,2 549,2 Recup. (%) 99,0 98,7 100,9 100,9 98,9 100,3 99,5 99,8 100,8 99,9 0,9

La regresión lineal del porcentaje de recuperación frente a concentración real de cada analito en la muestra, dio lugar a las ecuaciones cuyos parámetros se detallan en la Tabla III.2.6. El método demostró ser exacto, ya que las rectas ajustadas muestran ordenadas al origen que contienen al 100% de recuperación en su intervalo de confianza del 95%. Además, el método demostró no poseer sesgo en la predicción debido a que la pendiente de la recta de regresión no fue estadísticamente distinta de cero, lo que implica que no existe variación de la recuperación con la concentración de la muestra, en el intervalo de trabajo.

Tabla III.2.6. Parámetros de la regresión de la recta de regresión Recuperado (%) vs.

Concentración Real (mg L-1) para Clorhidrato de Fexofenadina y Clorhidrato de

Pseudoefedrina.

Parámetro FEX PEF

Número de muestras (N) 9 9

Pendiente ± SD -0,007 ± 0,009 0,004 ± 0,006

Intervalo de confianza de la Pendientea -0,024 − 0,010 -0,007 − 0,015

Contiene el “0” SI SI

y0 ± SD 101,4 ± 2,2 98,0 ± 2,8

Intervalo de confianza de y0a 97,3 – 105,5 92,8 – 103,2

Contiene el “100%” SI SI

a_{Los intervalos de confianza fueron calculados utilizando t}

(0,95,8) = 1,86.

Por otra parte, al efectuar las regresiones lineales entre las concentraciones reales de cada analito frente a los correspondientes valores predichos, se obtuvieron las rectas cuyos parámetros se detallan en las Ecuaciones III.2 y III.3. Asimilando la concentración predicha de analito a la respuesta instrumental, estos resultados indicaron claramente la linealidad del método en el intervalo estudiado. Por otra parte, los resultados obtenidos pasaron la comparación conjunta de “ordenada al origen cero” y “pendiente unidad” con un nivel de confianza del 95%, indicando que el método provee resultados exactos y no sesgados.166

[FEX]predicho = (4,4 ± 5,5) + (0,98 ± 0,02) × [FEX]real; r2= 0,9966; N= 9 [III.2] [PEF]predicho = (-8,3 ± 12,9) + (1,02 ± 0,03) × [PEF]real; r2= 0,9952; N= 9 [III.3]

III.2.5. Aplicación del Método Propuesto a Productos Farmacéuticos Comerciales.