Selectividad e interferencia 146

Esta ecuación al igual que la ecuación 5.08 puede escribirse reemplazando

σ

_b por

s

_b considerando una muestra de por los menos 25 blancos químicos.31

5.1.2.4. Selectividad e Interferencia

La selectividad indica hasta qué punto el método propuesto es capaz de detectar el

analito inequívocamente de otros componentes presentes en la muestra. Aquellas especies que puedan llegar a interferir con la señal analítica del sustrato en estudio se le llaman interferentes.

Teniendo en cuenta la presencia de interferentes, los métodos analíticos pueden clasificarse según su selectividad como sigue.24

 Método Universal: presenta sensibilidades comparables para un gran número de analitos con propiedades muy diversas.

 Método Selectivo: cuando la sensibilidad es alta para un determinado grupo de especies químicas.

5.1.2.5. Precisión

La precisión del método, aplicado en determinadas condiciones, se valida comparando la varianza de los resultados, , con la de la referencia, (que es la esperada o requerida para el método aplicado en condiciones similares). Si la primer varianza no es mayor que la segunda, la precisión del método queda validada.24

Es conveniente hacer distinción de la precisión entre dos condiciones de trabajo extremas. Por un lado, las condiciones de repetitividad la cual se caracterizan por un grado de control a corto plazo sobre el método analítico (misma muestra, mismo operador, iguales condiciones). Por el otro, las condiciones de reproducibilidad en la cual se incluyen factores que influyen a largo plazo (diferentes condiciones: muestra, operador, instrumentos, laboratorio, etc.).23,24

En general, los resultados obtenidos en las dos condiciones extremas suele dar una idea suficiente sobre la magnitud de las fuentes de varianza implicadas. Las varianzas pueden obtenerse a partir de los resultados analíticos de un ANOVA, y se deben incluir en las especificaciones del método.24

5.1.2.6. Exactitud

Cuando se aplica un método analítico es necesario saber cuánto se aproxima la determinación de concentración al verdadero valor. Esto se expresa como la exactitud del método. ISO define la exactitud como el grado de concordancia entre el resultado de la aplicación de un método analítico y el valor de referencia aceptado del analito.30

Los principales métodos que se proponen para el estudio de la exactitud son:

 Verificación con un material de referencia certificado (MRC).

 Ensayos de recuperación sobre matrices o muestras reales.

 Comparación de los resultados del método propuesto con un método de referencia.

A continuación se extiende la explicación sobre los ensayos de recuperación, ya que se emplearon como método analítico para evaluar la exactitud y selectividad de la metodología de análisis empleada para la detección de CZL.

5.1.2.6.1. Ensayos de Recuperación

Se entiende por recuperación,

R

, a la eficiencia del método analítico para recuperar y medir el analito adicionado en una matriz real.25

El ensayo de recuperación consiste en agregar cantidades conocidas del analito a una matriz real, antes del procesamiento de la muestra, y luego se determina la correspondiente curva de calibración. Esta curva de calibración se compara con la calibración en ausencia de matriz. Si ambas curvas coinciden se concluye que la recuperación es 100,0 % y que la interferencia de la matriz es despreciable. Si las curvas no se superponen se asocia a un posible efecto matriz.24 El efecto matriz produce errores sistemáticos por exceso o por defecto y, en consecuencia, aumenta proporcionalmente con la concentración del analito.24

Se define el factor de recuperación o simplemente recuperación,

R,

como la cantidad de analito cuantificado por el método propuesto (

Q

M_{) dividida la cantidad original presente}

en la muestra previa a un proceso de extracción y/o preconcentración (

Q

R_{), como lo}

expresa la siguiente ecuación

(5.14)

Se distingue también la recuperación aparente,

R

_A, definida como el cociente entre la cantidad de analito determinada a partir de la curva de calibración del método propuesto (

x

M_{) y el valor de referencia (}

_x

R_{) como se expresa en la ecuación 5.15. El valor}

_x

R _{es la}

cantidad de analito adicionada a la muestra antes del proceso de medición.34,35

Para los distintos niveles de fortificado se obtienen los correspondientes valores de

R

_A y a partir de estos se puede obtener el promedio de las recuperaciones aparentes, , definido por la ecuación 5.16 siguiente

∑

(5.16)

Para examinar la exactitud del método, se evalúa si el valor de es significativamente diferente al 100,0 % de recuperación mediante una prueba de significación

t

bilateral a un dado nivel de significación planteando como hipótesis nula H0:

% = 100,0 %. El valor del estadístico

t

se calcula mediante la ecuación 5.17.

√

(5.17)

Donde

n

representa el número de ensayos de recuperación considerados para calcular y

s

, la desviación estándar muestral.

El valor obtenido de

t

se compara con un valor

t

crítico (

t

_{α, n - 1}) tabulado según el nivel de significación elegido y los grados de libertad (

1

). Si el valor de

t

calculado es menor que

t

_{α, n - 1} se dice que el método analítico utilizado es exacto.

5.2. OBJETIVOS

En esta etapa se propuso desarrollar un método analítico sencillo que pueda detectar CZL en presencia del receptor macrocíclico, que mejor respuesta analítica ha proporcionado, en un rango de concentraciones que incluya la concentración máxima admisible en matrices de agua para consumo humano.

Como objetivos específicos se planteó validar el método analítico propuesto mediante la obtención de los parámetros analíticos correspondientes aplicando herramientas

estadísticas adecuadas. Por último, evaluar la aplicabilidad del método para determinar CZL en matrices reales de agua.

5.3. SECCIÓN EXPERIMENTAL 5.3.1. Instrumentación

Los equipos empleados para la preparación de las muestras, el control de la temperatura y la determinación de los espectros de fluorescencia se describen en la sección 3.3.1 (capítulo 3) de esta tesis.

5.3.2. Reactivos y procedimiento

5.3.2.1. Reactivos

Las especificaciones de los reactivos empleados para el desarrollo de los experimentos se describen en el capítulo 3. Las sales inorgánicas empleadas en el estudio de interferentes fueron reactivos comerciales de grado analítico.

Los solventes empleados fueron: agua deionizada calidad Milli-Q obtenida de un purificador Millipore y metanol grado HPLC Sintorgan.

5.3.2.2. Procedimiento general

Las soluciones concentradas de CZL se prepararon siguiendo la misma metodología detallada en la sección 3.3.2.2 (capítulo 3).

El método utilizado para adquirir los espectros de emisión de fluorescencia de CZL, se obtuvo de acuerdo a los siguientes parámetros instrumentales (en espectrofluorímetro JASCO) fueron:

o Ancho de rendijas de excitación y emisión: 10,0 nm o Potencia del Detector = muy baja (very low)

o Velocidad de barrido = 500,0 nm/min

En todos los casos se registraron las áreas totales de los espectros de emisión. Y se utilizó una cubeta de cuarzo de 1,0 cm de paso óptico. A las longitudes de onda de

excitación de CZL (

λ

_exc = 290,0 nm), la absorbancia de la concentración más alta de HP

β

- CD (10,0 mM) fue menor a 0,05.

En las mediciones espectrofluorimétricas siempre se utilizó como solución de referencia una concentración de CZL 5,0

μ

M en un 95,0 % v/v de buffer fosfato pH = 6,994 y 2,0 % v/v de metanol y enrasando con agua Milli-Q. Los experimentos se realizaron a (25,0  0,1) ºC.

In document Diseño, síntesis y caracterización de nanocavidades para la construcción de dispositivos moleculares (página 172-177)