Sensores construidos en la Universidad Tor Vergata de Roma

Estos sensores, al igual que los comerciales de Dropsens, contienen tres electrodos serigrafiados (trabajo, referencia y auxiliar) mediante el uso de tintas y la superposición de diferentes capas. Fueron suministrados por el laboratorio de biosensores de la Universidad de Florencia, y posteriormente fueron modificados y utilizados en la Universidad Tor Vergata de Roma durante una estancia realizada en esta última.

Para ello se emplearon una máquina DEK 245 y las tintas de grafito (Electrodag 421), plata (Electrodag 477 SS RFU) y la aislante (Electrodag 6018 SS) suministradas por Acheson Italiana 2. Los soportes sobre los que se serigrafiaron los electrodos fueron láminas de poliéster flexible (Autostatat HT5). Así, se obtuvieron sensores formados por un electrodo auxiliar y uno de trabajo (diámetro de 3 mm), ambos de grafito, y uno de referencia (a partir de la tinta de plata) como muestra la

Figura 3.3. Después de cada deposición de tinta, ésta se dejó secar a 110 ºC durante 10 min.

DS

Aplicación de biosensores amperométricos de polisulfona/nanotubos de carbono en el análisis de muestras reales

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Figura 3.3 Electrodo serigrafiado sobre poliéster constituido por dos electrodos de grafito (auxiliar y trabajo) y por uno de plata (referencia) siguiendo la misma configuración serigráfica que en la figura Figura 3.2.

Para las aplicaciones posteriores que se dieron a estos electrodos, se modificó el electrodo de trabajo mediante la deposición de azul de Prusia (PB) que actúa como mediador electroquímico3. Esta modificación de los sensores consistió en la formación in situ del mediador a partir de soluciones precursoras, 0.1 M de ferricianuro potásico y 0.1 M de cloruro de hierro (III), ambas en HCL 10 mM. Primero se depositaron 20 μl de FeCl3 cubriendo todo el área del electrodo de

trabajo evitando el contacto con el resto de los electrodos, y a continuación se añadieron 20 μl de K3Fe(CN)6.El paso siguiente fue agitar la lámina de sensores en

un agitador orbital durante 10 min y a continuación enjuagar la solución resultante de PB con unos mililitros de HCl 10 mM. Finalmente, se secó durante 1 h a 100 ºC para obtener una capa de PB estable y más activa. Estos sensores se han de conservar en seco, a temperatura ambiente y en ausencia de luz.

3.2.Inversión de fase

Como se ha descrito previamente en el apartado 1.6.1 del capítulo 1, la inversión de fase es un proceso en el cual un polímero disuelto, en presencia de un no solvente, precipita de manera que se forma el polímero sólido. Ésta propiedad, característica de la polisulfona empleada en nuestro trabajo, puede aprovecharse para la incorporación de material biológico durante el proceso de precipitación, de manera que éste queda inmovilizado en la membrana recién formada. Así, en este trabajo el proceso de inversión de fase se ha utilizado para la construcción de biosensores mediante la inmovilización de biomoléculas en membranas de PS/CNT.

Dado que la polisulfona es un polímero no conductor, su uso como matriz para sensores amperométricos es limitado. Es por ello, y por su capacidad para incorporar

3. Experimental

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una gran diversidad de materiales, que se ha desarrollado una mezcla de PS/CNT que confiera al nuevo material ambas propiedades, la posibilidad de incorporar biomoléculas y obtener un material compósito conductor que actúe como transductor.

La metodología para la preparación de membranas poliméricas por inversión de fase y su uso en sensores se lleva a cabo en varios pasos. Sin embargo, se ha de tener en cuenta que las proporciones de CNT, polisulfona y mediadores electroquímicos empleados en cada estudio se han modificado en base a diferentes factores. Uno de ellos es la morfología del sensor de trabajo utilizado, ya que su adherencia a la membrana formada varía en cada caso.

El primer paso consiste en la disolución de la polisulfona sólida en DMF, que actúa como solvente en el proceso de inversión de fase. A continuación se añaden los CNTs, y en los casos que convenga, los mediadores electroquímicos. Los CNTs han de ser purificados previamente a su uso debido a que contienen partículas metálicas. Esta purificación se lleva a cabo mediante ebullición en HNO3 6 M en

agitación durante 2 horas y su posterior secado a 80 ºC. Dado que los CNTs tienden a agregarse, la mezcla se dispersa durante 1 h para su homogeneización. Por otro lado, se ha de preparar la disolución de inversión de fase. Se trata de una disolución acuosa en la que pueden añadirse las biomoléculas que actuarán como receptores.

Como se puede observar en la Figura 3.4, según el tipo de electrodos empleados para el desarrollo de los biosensores se utilizan dos metodologías diferentes para la construcción de la membrana de PS/CNT. Para los electrodos planos construidos en nuestro laboratorio, el primer paso es superponer la pantalla serigráfica metálica que permite imprimir sobre el electrodo de trabajo. Colocando una cantidad apropiada de la mezcla de PS/CNT preparada sobre la pantalla y arrastrándola de manera homogénea y controlada, se consigue serigrafiar la nueva capa que dará lugar a la membrana. Después de esto, los electrodos se sumergen en la disolución de inversión de fase durante 5 minutos y se lavan durante 5 minutos más en una disolución agitada de tampón de fosfato (PBS). Todo el proceso debe llevarse a cabo con la máxima celeridad posible ya que la mezcla de PS puede empezar a precipitar antes de estar en contacto con la solución de inversión de fase por el efecto de la humedad ambiental.

Aplicación de biosensores amperométricos de polisulfona/nanotubos de carbono en el análisis de muestras reales

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Figura 3.4 Metodología llevada a cabo para la realizar la inversión de fase en los electrodos desarrollados por nuestro grupo (A) y los comerciales de Dropsens (B).

Por otro lado, cuando se utilizan los sensores comerciales de Dropsens se requiere un paso previo de activación a su modificación con la membrana de polisulfona. Con ello se consigue una buena calidad de la señal amperométrica cuando se trabaja con el biosensor reduciendo el ruido eléctrico. Con este objetivo se llevan a cabo medidas de voltamperometría cíclica en una disolución de ferricianuro potásico (K3Fe(CN)6) 0.05 M preparada en tampón fosfato, entre -0.6 V

y + 0.6 V vs. Ag/AgCl como electrodo de referencia, 100 mV/s como velocidad de barrido y 9 mV de saltos de potencial. Con la aplicación de 5 ciclos se obtiene una mejora considerable de la calidad de la señal, como se muestra en la Figura 3.5 .

Figura 3.5 En el gráfico A se muestra un proceso de activación mediante 5 voltamperometrías cíclicas realizada con el sensor comercial de Dropsens en una disolución de K3Fe(CN)6 5 mM preparada en tampón fosfato. En el gráfico B se muestran las medidas experimentales obtenidas cuando se realizan calibrados añadiendo diferentes alícuotas de la misma disolución de ferricianuro para un sensor en el que se ha llevado a cabo el paso de activación con 5 ciclos, y en el que no.

-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 -1.0x10-3 -7.5x10-4 -5.0x10-4 -2.5x10-4 0.0 2.5x10-4 5.0x10-4 7.5x10-4 I ( μ A ) E (V) 1 Ciclos 5 Ciclos 10 Ciclos 25 Ciclos A 0 50 100 150 200 250 300 350 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0 Ciclos I ( μ A) t (s) 5 Ciclos B

3. Experimental

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Una vez realizado este paso, se procede a la formación de la membrana sobre el sensor. Para ello se deposita una gota de la mezcla PS/CNT cubriendo la totalidad del electrodo de trabajo con cuidado para no alterar los electrodos de referencia y auxiliar. El paso siguiente es la inversión de fase, depositando una gota de la disolución acuosa sobre el electrodo de trabajo que se lava transcurridos 5 minutos. Cuando no están en uso, los biosensores de mantienen a 4 ºC sumergidos en una disolución de tampón fosfato.