Una de les principals vies de senyalització relacionada amb els microdominis raft és la via de la família Ras (formada principalment per tres membres, H-, K-, i N-Ras) que controla les diferents vies de senyalització responsables de la proliferació i diferenciació cel.lular [Prior IA, Hancock JF2001; Prior IA et al,2001]. Les isoformes de Ras presenten una gran homologia de seqüència excepte en una regió anomenada regió hipervariable, que conté el domini d’unió a membrana, el motiu C-terminal CAAX. Diverses modificacions postraduccionals en aquest domini (farnesilació, palmitoïlació) dirigeixen el precursor citosòlic de cada isoforma a un microdomini de membrana determinat. H-Ras està palmitoïlat mentre que K-Ras té una cua polibàsica, i per tant utilitzaran diferents sistemes d’ancoratge a la membrana. Aquesta compartimentalització, i el moviment que H-Ras presenta d’un domini a l’altre en activar-se [Prior IA, Hancock JF2001] els hi permet activar efectors diferents (revisat a Ehrhardt A et al, 2002).
Fig 4. Compartimentalització de les isoformes H- i K-Ras a la membrana [Hancock JF,2003]
Ras, unit estretament a la membrana, cicla entre un estat actiu i un d’inactiu, unit a GTP o GDP respectivament (Fig.5). Aquest procés està regulat per la pròpia activitat GTPàssica de la proteïna, i per proteïnes que estimulen aquesta activitat. Aquestes proteïnes van des del citosol cap a la membrana per activar o desactivar Ras. El procés d’activació requereix el recanvi del nucleòtid difosfat pel trifosfat (de GDP a GTP), i està mediat per les GEFs (guanine-exchanging-factors). Nous factors GEF com per exemple RasGRP i RasGRF s’han afegit recentment als ja descrits Sos i Sos2 [Campbell SL et al, 1998]. El procés d’inactivació (de GTP a GDP) està regulat per les GAPs (GTPase activating proteins). Les GAPs s’agrupen en quatre famílies: p120RasGAP, neurofibromina NF-1, SynGAP i GAP1. En el reclutament de GAPs i GEFs cap a la membrana participen diferents mecanismes moleculars (revisat per Cullen i Lockyer al 2002) [Cullen PJ, Lockyer PJ2002].
Fig 5. Cicle d’activació/inactivació de Ras [Walker SA et al, 2003].
La senyalització de Ras, que activa finalment ERK/MAPK, regula la proliferació cel.lular. S’activa a partir de receptors de membrana, tot i que la seva maquinària també s’ha trobat activada al compartiment endosomal [Pol A et al, 1998]. Raf1 acobla el senyal de Ras amb les MAPKs, va cap a la membrana quan s’activa Ras, assistit per proteïnes de la família 14-3- 3. Raf1 interacciona pel seu domini RBD (Ras Binding Domain) amb Ras només si està unit a GTP (i per tant actiu). Després Raf fosforila (activant) a Mek1 i Mek2, que fosforilaran a MAPK1 i MAPK2 respectivament. Les MAPKs tenen molts efectors,entre ells factors de transcripció per proteïnes que regulen la transició G1/S com la ciclina D1.
Aquesta via de les MAPKs, és depenent de factors de creixement, i també de calci. El cicle d’activació-desactivació de Ras mediat per GEFs i GAPs respon a oscil.lacions en els nivells intracel.lulars de calci [Cullen PJ, 2006]. La cascada de senyalització de Ras està interconectada amb moltes altres vies, com per exemple la de la fosfolipasa C (que alhora genera un pic de calci a través del missatger secundari IP3), o la família PKC (ser/thr quinases activables per calci i diacilglicerol). Aquestes interconexions s’intercalen a la via de les MAPKs en diferents nivells [Marais R et al,1998].
La localització de les isoformes H i K a diferents dominis de membrana fa que puguin activar vies de senyalització diferents, específiques de cada localització [Roy S et al 1999; Roy S et al, 2002], que s’anomenen vies de senyalització específiques d’isoforma. Més concretament, sabem que l’H-Ras ha de localitzar-se en un subtipus de raft determinat, les caveoles, per a senyalitzar, on resta en un estat inactiu i només així pot ser estimulat correctament, i passar als sots de clatrina (no raft) des d’on s’internalitzarà. La depleció de colesterol afecta la capacitat d’H-Ras però no la de K-Ras (que es localitza a zones no ordenades de membrana), per activar el seu efector comú Raf1 [Roy S et al 1999]. A més, està demostrat que la depleció de colesterol (uns nivells de colesterol més baixos a la membrana) estimulen l’estat actiu (unit a GTP) de Ras, indicant que el colesterol, i les caveoles, són necessàries per a una correcta desactivació de Ras [Smart EJ et al, 1996; Scheiffele P et al, 1998; Pol A et al, 2001], que és molt important pel control de la proliferació cel.lular.
El Ras oncogènic està permanentment unit a GTP, i no pot ser desactivat amb normalitat pels bescanviadors de nucleòtids GAPs. Aquestes GTPases tenen molta importància en la senyalització,i estan regulades per diferents factors, com es veurà més endavant.
ENDOCITOSI I TRÀFIC INTRACEL.LULAR
L’endocitosi comença a la membrana plasmàtica, el límit i primer filtre entre la cèl.lula i l’exterior. La internalització o endocitosi a la membrana es divideix bàsicament en dos tipus: internalització depenent de clatrina (vesícula amb recobriment de clatrina) i internalització independent de clatrina. S’han anat afegint nous subtipus dins de cada un d’aquests grups [Kirkham M, Parton RG 2005].
La cèl.lula té tres sistemes principals diferents per recobrir una vesícula: utilitzant COPI, COPII o clatrina (Fig.6). Les vesícules COPI s’ocupen del transport retrògrad, que és el que va des del Golgi fins al reticle, i també són molt importants en transport entre les cisternes de Golgi. Les COPII, viatgen des del reticle fins al Golgi [Wieland F, Harter C 1999]. A aquests tres sistemes cal afegir-hi les caveoles (on el recobriment seria la caveolina) i el retròmer.
Fig 6. Transport de vesícules recobertes [Bonifacino JS, Glick BS 2004].
Els sots de clatrina són estructures de 80-160 nm de diàmetre que ocupen aproximadament un 3% de la membrana plasmàtica. Hi ha dues vies de transport on trobem vesícules recobertes de clatrina, des de la membrana plasmàtica cap als endosomes i des del Golgi cap als endosomes o membrana [Kirchhausen T 1999; Lewin DA et al, 1998; Kirchhausen T 2000a; Kirchhausen T2000b]. La clatrina va ser identificada al 1976 per Pearse [Pearse BM1976], tot i que les vesícules recobertes ja s’havien vist anys abans en oòcits [Roth TF, Porter KR1964]. La clatrina té una estructura anomenada triskelion, i els diferents triskelions es van cap-i- culant entre ells folrant parts de la membrana plasmàtica reclutats per les proteïnes adaptadores AP1 i AP2, per acabar recobrint totalment la vesícula [Kirchhausen T 2000a; Kirchhausen T 2000b ; Rapoport I et al, 2008]. Aquests polímers polièdrics poden ser plans o esfèrics, adaptant-se a la forma de la membrana o de la vesícula escindida.
L’endocitosi independent de clatrina inclou la fagocitosi (procés depenent d’actina pel qual les cèl.lules “s’empassen” partícules externes de mida gran, per extensió i fusió de pseudòpods, la macropinocitosi (procés també depenent d’actina però per a la captació de fluids), tot el que s’internalitzi en vesícules no recobertes, i també l’endocitosi de caveoles (Fig.7).
clatrina indepenent de clatrina sot recobert de clatrina invaginació fagocítica macropinocitosi invaginació no recoberta caveola Ø 80-160nm Ø > 0.5 Pm Ø 0.2-5 Pm Ø ~100 nm Ø 50-100nm Caveolina RhoA cdc42
clatrina indepenent de clatrina
sot recobert de clatrina invaginació fagocítica macropinocitosi invaginació no recoberta caveola Ø 80-160nm Ø > 0.5 Pm Ø 0.2-5 Pm Ø ~100 nm Ø 50-100nm Caveolina RhoA cdc42
Fig 7. Vies d’internalització en cèl.lules eucariotes
Un cop els lligands són endocitats a la membrana plasmàtica mitjançant vies dependents o independents de clatrina, aquests han de ser classificats i transportats als seus destins intracel.lulars, i a partir d’aquí endosomes i transport intracel.lular formen un tot.
Pràcticament totes les vies d’internalització conflueixen als endosomes primerencs perifèrics. En general és aquí on el complex receptor-lligand es desacobla i els lligands i receptors són enviats al lloc corresponent en un procés que en anglès s’anomena molt il.lustrativament
sorting. En la majoria dels casos la càrrega serà transportada fins al endosomes tardans o LE (LE ,late endosomes) mitjançant vesícules portadores o un procés de maduració, i els receptors seran retornats a través d’una xarxa citoesquelètica regulada per proteïnes de transport (Rab i Rho) cap a la membrana (reciclatge). Els endosomes tardans maduren després fins a lisosomes (orgànuls amb un pH àcid i que contenen enzims hidrolítics), on té lloc la degradació dels lligands/receptors endocitats. Hi ha quatre models diferents proposats per la transferència de càrrega des dels endosomes tardans als lisosomes. Segons el primer model (maduració) els endosomes tardans maduren cap a lisosomes per acidificació, i adquisició gradual de components lisosomals alhora que es van perdent els components d’endosoma tardà. Un segon model (vesicular) són unes vesícules intermediàries (pre-lisosomes) que s’escindeixen dels endosomes tardans i es funsionen amb els lisosomes. El tercer model proposa un contacte fugaç (kiss and run) entre els LE i els lisosomes (kiss), durant el qual s’intercanvien la càrrega, per a separar-se de nou (run). Segons el darrer model o model híbrid, els endosomes tardans i els lisosomes es fusionen formant una estructura híbrida permanent [Luzio JP et al, 2007]. Hi ha endosomes que també s’anomenen cossos multivesiculars (MVBs), doncs poden contenir vesícules internes formades per invaginacions de la pròpia membrana. Es considera que un MVB o endosoma és tardà o madur quan ja ha perdut totes les proteïnes que s’havien de reciclar i per tant ja és competent per fusionar-se o transformar-se en lisosoma [Woodman PG, Futter CE2008].
Aquest sistema endosoma/lisosoma pot enviar i rebre càrrega des del TGN (trans Golgi network) via vesícules intermediàries. El TGN es va definir com un orgànul en tàndem amb les cisternes trans del Golgi. Té una estructura túbulo-vesicular, i està constantment rebent i enviant vesícules [Rothman JE 1981]. El transport vesicular no es pot separar del citoesquelet, que forma “carreteres” per on es mouen les vesícules. Tot i això, sempre hi ha excepcions, i hi ha vesícules o “càrregues” determinades que poden literalment saltar d’un compartiment a un altre directament.
Totes aquestes vies de transport estan regides per tres principis bàsics: la classificació (sorting), el direccionament (targeting) i la fusió (Fig.8).