En otra serie de experimentos quisimos conocer si el cannabinoide endógeno 2- araquidonilglicerol también induce el silenciamiento de los botones sinápticos. Con este objetivo tratamos las células granulares transfectadas con vGlut1-pHluorina con 2-araquidonil glicerol (2-AG, 60μM, 15min, Figura IV-10A). Este tratamiento disminuyó la respuesta de exocitosis-endocitosis inducida por KCl (Figura IV-10B, C) debido al incremento en el porcentaje de botones silentes (9,2±2,6%) en comparación con células control (2,1±1,3%), aunque el incremento no fue significativo (Figura IV-10D). Dado que a diferencia de los cannabinoides sintéticos, el endocannabinoide 2-AG es susceptible de ser degradado, determinamos si la ausencia de un efecto significativo en el silenciamiento podía ser debida a la degradación del 2-AG. Así, el mismo tratamiento combinado JZL184 (1µM, 30min) un inhibidor de la monoacil glicerol lipasa (MGL), enzima que degrada el 2-AG in vivo (Dinh et al., 2002; Dinh et al., 2004; Vandevoorde y Lambert 2007), aumentó significativamente (p<0,05) el número de botones silentes inducidos por 2-AG (35,3±11,7%, Figura IV-10D). El inhibidor JZL184 por sí mismo también mostró una tendencia a aumentar el número de botones silentes (11,8±4,3%) aunque no de manera significativa (Figura IV-10D), indicando la producción tónica de endocannabinoides en nuestras condiciones de cultivo. Por tanto, el hecho de el endocannabinoide 2-AG también induzca el silenciamiento presináptico sugiere la posible relevancia fisiológica de este fenómeno.
122
Figura IV-10. El endocannabinoide 2-araquidonilglicerol también induce el silenciamiento presináptico. A) Protocolo
experimental. B) Respuesta de exo-endocitosis promedio de todos los botones sinápticos normalizada a la respuesta con NH4Cl en condiciones control y tras el tratamiento con 2-araquidonil glicerol (60μM, 15min), JZL 184 (1μM, 30min); y JZL184+2-AG. (Control: N=5, n= 201; 2-AG: N=10, n=271; JZL184: N=6, N=115; JZL184+2-AG: N=8, n=214 botones. N, nº de cubreobjetos; n, nº de botones sinápticos). C) Distribución de la probabilidad acumulada de las respuestas exo-endocitóticas individuales. D) Porcentajes de botones silentes. ANOVA con test de Bonferroni, * p<0,05.
7. El silenciamiento presináptico está relacionado con una reducción en los niveles de AMPc
Dado que los efectos a largo plazo de la señalización del receptor CB1 implican la inhibición de la adenilato ciclasa (AC) y que la depresión duradera de la transmisión sináptica (LTD) dependiente de los receptores CB1 también se ha relacionado con cambios en los niveles de AMPc (Chevaleyre et al., 2007; Mato et al., 2008; Yasuda et
al., 2008; Heifets y Castillo 2009) nos planteamos si una reducción en los niveles de
este mensajero era la responsable del silenciamiento presináptico inducido por los cannabinoides. Por esa razón se llevaron a cabo experimentos con el inhibidor de la AC SQ22536 que de acuerdo con esta idea debería inducir por sí mismo el silenciamiento presináptico y además ocluir el silenciamiento inducido por el agonista cannabinoide. La incubación de las células durante 25min con SQ22536 (100μM) redujo la respuesta de exocitosis-endocitosis promedio de todos los botones sinápticos (Figura IV-11B, C) e incrementó significativamente (p<0,05) el porcentaje de botones silentes (23,0±4,1%)
123
respecto al control (1,5±0,8%). El grado de silenciamiento inducido por SQ22536 fue similar al inducido por el tratamiento con HU210 (18,4±3,1%) (Figura IV-11D). Además el tratamiento con SQ22536, previo a la incubación con HU210 (Figura IV-11A) ocluyó el silenciamiento inducido por el agonista cannabinoide (19,6±2,9%). Estos resultados indican la posible implicación de una disminución de los niveles de AMPc en el fenómeno de silenciamiento presináptico.
En otra serie de experimentos se determinaron los niveles de AMPc en el cultivo primario de neuronas de cerebelo (Figura IV-11E). Los niveles basales de este mensajero (1,28±0,02 pmoles/105 células) disminuyeron significativamente (p<0,01) tras la inhibición de la AC con SQ22536 (0,75±0,06 pmoles/105 células). El tratamiento con HU210 tuvo un efecto parecido (0,84±0,06 pmoles/105 células), mientras que la combinación de ambos indujo una reducción aún mayor de los niveles de AMPc (0,84±0,06 pmoles/105 células). Lo que sugiere que no toda la actividad de adenilato ciclasa está bajo el control de los receptores CB1. En conjunto, estos datos indican que el silenciamiento requiere una reducción drástica en los niveles de AMPc celulares a pesar del amplio rango dinámico de los niveles de este nucleótido ya que la activación de la adenilato ciclasa con forskolina (50μM, 15min) incrementa los niveles del nucleótido unas 70 veces sobre el nivel basal (89,07±12,64 pmoles/105 células). Estos resultados que relacionan el silenciamiento presináptico con niveles de AMPc bajos en la célula concuerdan con el hecho que el AMPc aumente el número de botones sinápticos funcionales (Ma et al., 1999). Además, experimentos previos del laboratorio han demostrado que el tratamiento con forskolina previene el silenciamiento inducido por HU210 (Ramirez-Franco et al., 2014), sugiriendo la reducción en los niveles de AMPc como posible responsable del silenciamiento de botones sinápticos.
124
Figura IV-11. La inhibicion de la adenilato ciclasa con SQ22536 también induce el silenciamiento presináptico y
ocluye el inducido por HU210. A) Protocolo experimental. B) Respuesta de exo-endocitosis promedio de todos los botones sinápticos normalizada a la respuesta con NH4Cl en condiciones control y tras el tratamiento con HU210 (5µM, 10 min); SQ22536 (100μM, 25min); SQ22536 + HU210. (Control N=6, n=267; HU210 N=8, n=434; SQ22536 N=7, n=367; SQ+HU210 N=8, n=558; N, nº de cubreobjetos; n, nº de botones sinápticos. C) Distribución de la probabilidad acumulada de las respuestas exo-endocitóticas individuales D) Porcentajes de botones silentes. ANOVA con test de Bonferroni, **p<0,01, ***p <0,001. E) Niveles de AMPc (pmoles/105 células) en las distintas condiciones: Control; HU210; SQ22536; SQ+HU210 y tras la adición de forskolina (50μM, 15min). El símbolo * indica la comparación entre los niveles basales frente al resto de tratamientos, mientras que # indica la comparación de forskolina con a otros tratamientos, ** o ## p < 0,01, mientras que *** es p < 0,001 (test de Welch).
La activación de los receptores CB1 con el agonista cannabinoide el WIN55512 (5μM, 10min) produjo resultados comparables a los obtenidos con HU210. WIN55512 redujo la respuesta de exocitosis-endocitosis promedio de todos los botones sinápticos (Figura IV-12B, C) y aumentó significativamente (p<0,05) el porcentaje de botones silentes (27,0±5,0%) en comparación con el control (1,7±0,9%) (Figura IV-12D). El inhibidor de la adenilato ciclasa SQ22536 silenció los botones sinápticos (26,9±5,9%) en magnitud comparable a la observada con WIN55512 y cuando SQ22536 se añadió antes del agonista cannabinoide también ocluyó la respuesta de WIN55512
125
(28,3±6,1%) lo que refuerza la idea de que el silenciamiento presináptico está asociado a una disminución de los niveles de AMPc.
Figura IV-12. La inhibicion de la adenilato ciclada con SQ22536 también induce el silenciamiento presinaptico y
ocluye el inducido por WIN55512. A) Protocolo experimental. B) Respuesta de exo-endocitosis promedio de todos los botones sinápticos normalizada a la respuesta con NH4Cl en condiciones control y tras el tratamiento con WIN55512 (5µM, 10min); SQ22536 (concentración, tiempo); SQ22536 + WIN55512. (Control: N=6, n=331; WIN5512: N=6, n=203; SQ22536: N=6, n=282; SQ+WIN55512: N=6, n=451; N, nº de cubreobjetos; n, nº de botones sinápticos. C) Distribución de la probabilidad acumulada de las respuestas exo-endocitóticas individuales. D) Porcentajes de botones silentes. ANOVA con test de Bonferroni, * p<0,05, ***p <0,001.
8. El aumento de los niveles de AMPc acelera la reversión del