Una posible clasificación de los sistemas enzimáticos que presentan las células vegetales se muestra a continuación (Clijsters y cols. 1999):
Peroxidasas (POD) Superóxido dismutasas (SOD)
Enzimas que metabolizan EROs
Catalasa (CAT) Ascorbato peroxidasa (APX) Monodehidroascorbato reductasa (MDHR)
Dehidroascorbato reductasa (DHR)
Enzimas del ciclo ascorbato-glutatión
Glutatión reductasa (GR) Enzima málica (ME)
Glucosa -6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) Isocitrato deshidrogenasa (ICDH)
Enzimas reductoras de NAD(P)+
Glutamato deshidrogenasa (GDH) Peroxidasas (POD) Superóxido dismutasas (SOD)
Enzimas que metabolizan EROs
Catalasa (CAT) Ascorbato peroxidasa (APX) Monodehidroascorbato reductasa (MDHR)
Dehidroascorbato reductasa (DHR)
Enzimas del ciclo ascorbato-glutatión
Glutatión reductasa (GR) Enzima málica (ME)
Glucosa -6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) Isocitrato deshidrogenasa (ICDH)
Enzimas reductoras de NAD(P)+
Glutamato deshidrogenasa (GDH)
7.1 Superóxido dismutasa (SOD)
La enzima superóxido dismutasa (EC 1.15.1.1) está presente en casi todos los organismos aerobios. Es una de las enzimas clave en los mecanismos de defensa frente al estrés oxidativo (Van Breusegem y cols. 2002) ya que actúa sobre los radicales superóxido (O2
•-), como se muestra en la siguiente reacción (Rio y cols. 2002; Scandalios 1993):
2 O2•¯ + 2H+ H2O2 + O2
Esta enzima hace que la reacción sea 10.000 veces más rápida que la dismutación espontánea (Bowler y cols. 1992) y requiere de la presencia de un cofactor metálico (Inzé y Montagu, 1995). Se clasifica según el cofactor sea cobre o zinc, hierro y manganeso (Cu/ZnSOD, FeSOD y MnSOD, respectivamente). Normalmente, la MnSOD se localiza en las mitocondrias de todas las células eucariotas, mientras que las Cu/ZnSOD se han encontrado en el citosol, peroxisomas y cloroplastos de las plantas superiores (Van Breusegem y cols. 2002).
7.2 Catalasa (CAT)
La enzima catalasa (EC 1.11.1.6) tiene como sustrato el H2O2 (Inzé y Montagu 1995; Mittler 2002; Van Breusegem y cols. 2002). Tiene una alta capacidad de reacción, pero muy poca afinidad por el H2O2 (Willekens y cols. 1997; Smirnoff 1998). Esta baja afinidad por el sustrato hace pensar que su papel principal sea la eliminación de H2O2 cuando está a elevadas concentraciones bajo condiciones de estrés (Mittler 2002; Smirnoff 1998). A diferencia de otras peroxidasas, la catalasa no requiere de un sustrato reductor para poder actuar (Inzé y Montagu 1995). Se localiza en los peroxisomas, glioxisomas y mitocondrias (Mittler 2002; Inzé y Montagu 1995; Asada 1992; Van Breusegem y cols. 2002). Los peroxisomas son orgánulos con diversas funciones en las células de las plantas y hongos, como la fotorrespiracion, la oxidación de los lípidos, el ciclo del glicoxilato y el metabolismo de las especies reactivas del oxígeno entre otras. Por ello el importante papel que tiene la catalasa en la eliminación de EROs en estos orgánulos (Rio y cols. 2002). Se han descrito tres variedades de esta enzima, con diferentes funciones. La cat1, encargada de eliminar el H2O2 producido en la fotorrespiracion, la cat2 tiene la función de eliminar el H2O2 que se forma durante el estrés oxidativo y la cat3 que elimina el H2O2 generado durante la oxidación de los ácidos grasos (Inzé y Montagu 1995).
7.3 Guaiacol peroxidasa (POD)
Se denomina guaiacol peroxidasa (EC 1.11.1.7) a un conjunto de enzimas presentes en el citosol, la vacuola y la pared celular en las células vegetales que, al igual que la catalasa y la ascorbato peroxidasa, tienen como sustrato al H2O2, al cual reducen hasta agua (Asada 1992; Mehlhorn y cols. 1996). Tanto esta enzima como la ascorbato peroxidasa (que se describe a continuación) son inducidas por la presencia de metales pesados (Clijsters y cols. 1999).
GR
7.4 Ascorbato peroxidasa (APX)
La ascorbato peroxidasa (EC 1.11.1.11) es una enzima que tiene como sustrato el H2O2, pero tiene una afinidad mayor que la catalasa, sugiriendo que el papel de esta enzima es regular el H2O2 cuando las concentraciones no son demasiado elevadas, como sucede en el metabolismo normal de las células, cuando no existe ningún tipo de estrés. (Mittler 2002; Smirnoff 1998). Se localiza en los cloroplastos, peroxisomas, citosol y mitocondrias (Conklin 2001). La ascorbato peroxidasa reduce el agua oxigenada a agua, usando como agente reductor el ascorbato (AsA), oxidándolo a monodehidroascorbato (MDHA) (Smirnoff 2000), catalizando la siguiente reacción:
H2O2 + AsA H2O + MDHA
7.5 Glutatión reductasa (GR)
La glutatión reductasa (EC 1.6.4.2) es una enzima que actúa reduciendo el glutatión disulfuro (GSSG) a glutatión (GSH) y necesita de la presencia de NADPH como agente reductor. Tiene un importante papel en la regeneración del glutatión, y es también parte del ciclo de Halliwell-Asada. En este ciclo, el glutatión se oxida para regenerar el ascorbato, como muestra la reacción:
GSSG + NADPH GSH + NADP+
Es la última enzima implicada en el ciclo de Halliwell-Asada, además de jugar un importante papel en numerosos procesos celulares (Inzé y Montagu 1995). Esta enzima se localiza en las plantas superiores en los plástidos y en el citosol. (Creissen y Mullineaux 2002).
7.6 Ciclo de Halliwell-Asada
Como se ha ido exponiendo anteriormente, el reciclado de las formas reducidas del ácido ascórbico y del glutatión a partir de sus formas oxidadas les obliga a depender mutuamente el uno del otro. Esto se manifiesta claramente cuando se analiza el ciclo de Halliwell-Asada, donde el ácido ascórbico oxidado (DHA) es reducido con electrones que proceden del GSH mediante la actividad catalítica de la DHAR (Foyer 1993; Foyer y cols. 1994). El glutatión se regenera, tomando electrones cedidos por el NADPH, a través de la actividad glutatión reductasa. Junto a este ciclo, en la figura 8 se muestra la interacción de una variedad de sistemas defensivos ante la presencia de las EROs (Asada 1992; Scandalios 1993; Inzé y Montagu 1995; Smirnoff 1998; Clijsters y cols. 1999; Smirnoff 2000; Conklin 2001; Mittler 2002).
Figura 8. Esquema de algunas de las enzimas implicadas en la defensa frente a las EROs.
SOD superóxido dismutasa; PER peroxidasas; CAT catalasa; APX ascorbato peroxidasa; MDHAR monodehidroascorbato reductasa; DHAR dehidroascorbato reductasa; GR glutatión reductasa; ASC ascorbato reducido; MDHA monodehidroascorbato; DHA
dehidroascorbato; GSH glutatión reducido; GSSG glutatión oxidado.
O2 O2 ·-POD H2A A 2-H2O CAT H2O + O2 SOD H2O2 2H+ C CiiccllooddeeHHaalllliiwweellll--AAssaaddaa H2O ASC MDHA APX NAD(P)H NAD(P)+ MDHAR DHA GSSG GSH DHAR NADPH NADP+ GR Mox Mred