1.1. SISTEMA EXPERIMENTAL I: anillos de aorta de rata
1.1.1. Animales utilizados
Se utilizaron ratas Wistar hembras sexualmente maduras, de cuatro a seis meses de edad, las cuales ya habían tenido al menos tres estros consecutivos. Los animales fueron alimentados con una dieta estándar para roedores, con provisión de agua ad libitum y mantenidos en ciclos de doce horas de luz y doce horas de
oscuridad. La actividad de los estros se evaluó mediante citología exfoliativa y aquellos animales elegidos para los ensayos experimentales presentaban estros de la misma duración. Todos los trabajos con animales se llevaron a cabo en el Bioterio del Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia de la Universidad Nacional del Sur, los cuales fueron avalados por la comisión asesora del Bioterio.
1.1.2. Obtención de anillos de aorta de rata
Los animales fueron sacrificados por dislocación cervical, la aorta torácica fue removida inmediatamente y colocada en solución fisiológica refrigerada a 4 ºC (Andersen y col., 1999). Se procedió a limpiar la aorta del tejido conectivo y adiposo adyacente y se cortó en pequeños anillos, de 15 a 20 mm aproximadamente. Se tomó especial cuidado se tomó para evitar el daño de la superficie endotelial.
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1.1.3. Tratamientos in vitro de los anillos de aorta de rata
Los anillos de aorta de rata (AAR) se utilizaron dentro de las dos horas posteriores a su aislamiento, periodo en el cual mantiene su viabilidad, la cual fue comprobada por su capacidad de responder al agonista natural del tejido vascular
“acetilcolina”. Los AAR fueron colocados en 1.5 ml del medio de incubación (Medio
D), cuya composición se detalla al pie de este párrafo. Se preincubaron durante 10 minutos en baño termostático (Vicking, modelo Dubnoff) a 37 ºC, con agitación continua (Andersen y col., 1999). Seguidamente, se inició el tratamiento con el agregado de la hormona por los intervalos de tiempo correspondientes a cada ensayo experimental. Paralelamente se procesó siempre un grupo control, el que recibió solamente el vehículo en el cual se solubilizó la hormona (isopropanol), en concentración menor a 0.1%. En los ensayos en los cuales se emplearon inhibidores y antagonistas, estos se agregaron al medio de incubación 30 minutos antes de comenzar el tratamiento con Pg. Las soluciones hormonales empleadas en todos los ensayos fueron siempre preparadas en el día del experimento minutos antes de comenzar el tratamiento.
Composición del Medio D:
Concentración final (mM) NaCl 145 KCl 5 MgSO4 1.2 CaCl2 1 Glucosa 10 Buffer Hepes, pH 7.35 10
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1.2. SISTEMA EXPERIMENTAL II: cultivos de células endoteliales y células de músculo liso vascular
Las CE y CMLV se obtuvieron por cultivo primario utilizando la técnica de explantes, a partir de anillos de aorta de ratas Wistar hembras (de tres a cinco semanas de edad) (Yeh y col., 2002; McGuire y Orkin, 1987). En las instalaciones del Bioterio se aisló la aorta toráxica en condiciones de asepsia, para lo cual el quirófano y el instrumental empleado se esterilizaron por irradiación con luz UV. El resto del procedimiento y todos los ensayos experimentales en los que se usaron CE y CMLV, se realizaron en un gabinete se seguridad biológica (Telstar Bio-II-A) disponible en el Laboratorio de Cultivo Celular. Luego de eliminar cuidadosamente el tejido conectivo y adiposo adyacente, la aorta se cortó en pequeños anillos de 2 mm de longitud (Esquema 2). Los anillos así obtenidos se cultivaron en placas de 10 cm de diámetro (NUNC) conteniendo 10 ml de medio de cultivo DMEM (libre de rojo de fenol y suplementado con 3.7 mg/L de bicarbonato de sodio (NaHCO3), 2
mM de L-glutamina y antimicrobianos: 100 U/ml de penicilina (60 μg/ml), 10 μg/ml de streptomicina y 2.5 μg/ml de amfotericina B), con el agregado de 20% de suero fetal bovino (SFB). Se empleó un incubador metabólico (Revco Habitat, Asheville, USA) con control automático de temperatura y CO2 (37 ºC, 5% de CO2). Durante los
primeros cinco días de cultivo, se liberan las CE. Finalizado este periodo, los anillos fueron transferidos a una nueva placa con medio DMEM fresco suplementado con 10% de SFB y antimicrobianos y se incuban durante cinco días. En esta nueva placa se obtuvo un cultivo mixto de CE y CMLV. Los anillos se retiran y se transfieren nuevamente a otra placa y se incuban durante otros cinco días. Se repite este paso una vez más y de esta manera se obtiene un cultivo puro de CMLV
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a los 20 días de iniciado el procedimiento. A los cultivos de CE y CMVL se les efectuó un recambio del medio DMEM con una frecuencia de 3 días. La pureza de los cultivos de ambos tipos celulares se estableció de la siguiente manera: (a) por la morfología característica que adoptan las células en cultivo al observarlas en un microscopio invertido de contraste de fase (Nikon Eclipse TS100). En el caso de las CE se observó la morfología característica de “cobblestone” en cultivos
confluentes, mientras que en el caso de las CMLV se observó la apariencia de
“valles y colinas”, (b) a través de inmunohistoquímica: se estudió la presencia de FvW en CE y su ausencia en CMLV y de la presencia de alfa actina en CMLV y su ausencia en CE (sistema Dako Cytomation En Vision), y (C) por la capacidad de las CE de sintetizar NO (Bachettiy Morbidelli, 2000). Todos los ensayos experimentales se realizaron empleando cultivos de CE o CMLV de pasajes 2 a 7.
A. Cultivo primario de CE. B. Cultivo primario de CMLV
(Tinción:hematoxilina-eosina)
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Esquema 2. Obtención de cultivos primarios de CE y CMLV a partir de aorta de rata por la técnica de explante.
1.2.1. Tratamientos in vitro de los cultivos de células endoteliales y células de músculo liso vascular
DMEM 20% SFB 5 días a 37ºC,
5% CO2
5% CO2
Transferir anillos de aorta
Transferir anillos de aorta (repetir este paso)
Descartar anillos DMEM 10% SFB 5 días a 37ºC, 5% de CO2 DMEM 10% SFB 5 días a 37ºC, 5% de CO2 CE Cultivo mixto de CE + CMLV Ratas Wistar (3-5 semanas) Remover asépticamente la aorta torácica Obtener pequeños anillos de la aorta Remover el tejido conectivo y adiposo adyacente DMEM 20% SFB dí 37ºC, Sembrar anillos Repicar y renovar medio de cultivodio CMLV Repicar y Transferir a (repetir este 5% de CO2 Descartar an 5% de CO2 Aorta
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Los cultivos de CE y CMLV se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de SFB hasta llegar a la confluencia necesaria para realizar los ensayos experimentales. En los casos que se requería sincronizar las células, las mismas se privaron de suero durante 24 horas y luego se reemplazó el medio de cultivo por DMEM fresco conteniendo 1% de SFB, medio en el cual se realizaron los tratamientos hormonales correspondientes. Se inició el tratamiento con el agregado de la hormona por los intervalos de tiempo correspondientes a cada ensayo experimental. Paralelamente se procesó siempre un grupo control, el que recibió solamente el vehículo (isopropanol), en una concentración inferior a 0.1%. En los ensayos en los cuales se emplearon inhibidores y antagonistas, estos se agregaron al medio una hora antes de comenzar el tratamiento hormonal. Las soluciones hormonales empleadas en todos los ensayos fueron siempre preparadas en el día del experimento, minutos antes de comenzar el tratamiento.