SISTEMAS TRANSPORTADORES DE FÁRMACOS

Nuevos sistemas farmacéuticos están siendo desarrollados para solucionar las limitaciones que conllevan las formas farmacéuticas convencionales. Los esfuerzos iniciales se centraron en mejorar las propiedades moleculares de las ya conocidas, para minimizar la degradación y pérdida de fármaco, prevenir los efectos adversos, incrementar la biodisponibilidad, así como el fármaco acumulado en el lugar de acción.

Existen diferentes tipos de nanosistemas, la mayoría diseñados como sistemas transportadores de fármacos, entre los que se encuentra por ejemplo los dendrímeros, liposomas, micelas, NPs, microesferas o niosomas.

Nanopartículas poliméricas

Las NPs son definidas como partículas menores de 1 µm de tamaño, de forma esférica y sintetizadas a partir de polímeros naturales o sintéticos. Se pueden encapsular en este tipo de partículas una gran variedad de fármacos, no solo hidrófilos sino también hidrófobos, así como vacunas y macromoléculas biológicas.

De entre los principales inconvenientes que hay que tener en cuenta a la hora de la síntesis de NPs se encuentra la opsonización, que debe reducirse para prolongar la circulación de estos sistemas para el uso clínico. Sin embargo, cubriendo la superficie de estas partículas con polímeros hidrofílicos o surfactantes, incluyendo copolímeros biodegradables como el polietilenglicol, se puede evitar.

Las NPs poliméricas son sistemas coloidales sólidos formados por copolímeros biocompatibles que tienen baja solubilidad en agua. Hay diferentes tipos de polímeros utilizados para la síntesis de NPs como el poliacrilcianocrilato, poliéster como polilactidos, o PLGA, algunas proteínas y polisacáridos.

El PLGA es uno de los polímeros desarrollados con más éxito, biodegradable y biocompatible, debido a que al hidrolizarse produce metabolitos monómeros, como el

111

ácido láctico y el ácido glicólico, los cuales son metabolitos naturales que se pueden encontrar en el cuerpo. Además, ha sido aprobado por la FDA para terapias en uso humano.

Según Kumari y col., existen diferentes mecanismos y factores que afectan a la liberación de fármacos. Las partículas más grandes tienen una liberación inicial más rápida (efecto burst) que las pequeñas. La capacidad para encapsular el fármaco es directamente proporcional a la manera en la que se libera. Si el fármaco está uniformemente distribuido, la liberación se produce por difusión o por erosión de la matriz bajo condiciones sumidero, como es el caso de las nanoesferas. Si la difusión del fármaco se produce más rápido que la erosión de la matriz, los mecanismos de liberación son controlados por el proceso de difusión. La liberación inicial es brusca y rápida, lo que se atribuye en la mayoría de los casos a las uniones débiles o al fármaco adsorbido sobre la superficie de la NP.

De esta manera, las NPs de PLGA han sido utilizadas como transportadores de una gran variedad de fármacos, péptidos, proteínas, vacunas y nucleótidos, debido a sus propiedades que permiten la protección del fármaco y la liberación sostenida.

Existen diferentes métodos para la síntesis de NPs poliméricas de PLGA y, dependiendo del método elegido, se pueden conseguir diferentes efectos en la liberación del fármaco. Estos métodos se pueden dividir en proceso de saling out, nanoprecipitación o difusión de solvente, o métodos de emulsificación (método de emulsión-evaporación o emulsión-difusión).

Mediante el método de síntesis por emulsión-evaporación, una vez emulsionado el disolvente orgánico en una fase acuosa que contiene el tensioactivo, se aplica un fuerte estrés para romper la emulsión y convertir las gotas en otras más pequeñas. El tamaño de las gotas afectará al tamaño de la NP formada. Por último, se produce la

112

eliminación del disolvente orgánico mediante evaporación, provocando la precipitación del polímero y la consiguiente formación de la NP.

El método de emulsión y difusión comienza disolviendo el polímero preformado en un disolvente orgánico que es parcialmente miscible en agua (por ejemplo, etil acetato, diclorometano, o acetona/metanol). A continuación se adiciona agua mediante agitación, formándose una emulsión, y posteriormente se produce la evaporación del disolvente resultando en la formación de las NPs.

El tensioactivo tiene un papel importante en la preparación de NPs, pues reduce la tensión superficial, resultando en pequeñas partículas. Algunos ejemplos serían el PVA, dextranos, o PEG, entre otros.

Posteriormente surgió la necesidad de solucionar los inconvenientes que conllevaban los fármacos hidrosolubles. Estos métodos combinan las ventajas de las técnicas de emulsificación y difusión de solvente y doble emulsión y evaporación de solvente, permitiendo utilizar el procedimiento de doble emulsión con parte agua y parte disolvente orgánico junto con surfactantes biocompatibles como el Pluronic F68 o el PVA. La diferencia respecto al método de una emulsión simple estaría en la aplicación de fuerte estrés sobre la primera emulsión para reducir el tamaño a través de un homogenizador o un sonicador.

Liposomas

Los liposomas se pueden definir como un ensamblamiento de lípidos anfipáticos formando una o varias bicapas lipídicas concéntricas que albergan en su interior un pequeño medio acuoso para la encapsulación de fármacos. Existen diferentes tipos de liposomas dependiendo del tamaño y de la lameralidad, tales como liposomas unilamelares gigantes (GUV), vesículas multilamelares (MLV), y pequeños y largas vesículas de liposomas unilamelares (SUV y LUV).

113

Los liposomas MLV se preparan mediante hidratación de una capa fina de fosfolípido bajo un flujo hidrodinámico. Los MLV obtenidos mediante este método, son heterogéneos en tamaño y lameralidad. Diferentes técnicas se han empleado para obtener SUV y LUV a partir de MLV, tales como prensa francesa, sonicación, homogenización o extrusión de membrana. La disminución de tamaño se obtiene sonicando los MLV, también a través de la prensa francesa, aunque en este segundo caso el tamaño obtenido sería mayor.

Si la formulación de liposomas preparada se pasa de manera repetida a través de un filtro de tamaño de poro menor, el tamaño de la población de liposomas obtenida sería homogénea y correspondería al tamaño de poro del filtro. La nueva generación de liposomas unilamelares se caracteriza por la inserción de metoxipropilenglicol (mPEG), al cual se le une 1,2-diesteraroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPSE), el cual se sitúa en la superficie interna y externa de la bicapa, obteniendo liposomas estabilizados estéricamente e inhibiendo la activación del complemento, evitando de esta manera ser capturados por el sistema fagocítico mononuclear. Por lo tanto, este sistema permanece en la circulación por más tiempo.

Se puede incrementar la eficiencia de encapsulación mediante un gradiente de sulfato de amonio. De esta manera, el liposoma incrementaría el fármaco encapsulado y, por consiguiente, el efecto producido, dado que el espacio que alberga el liposoma en su interior es pequeño y limita el espacio del fármaco, alcanzando niveles bajos de carga del mismo.

Además, el mantener el fármaco más tiempo encapsulado, permite que llegue al lugar de acción con la dosis adecuada asegurando así la biodisponibilidad y la actividad farmacológica. Este método de gradiente de sulfato de amonio fue estudiado para encapsular doxorrubicina en liposomas pegilados (Doxil®), alcanzando un alto

114

ratio fármaco/lípido. Gracias a estos avances se ha permitido el uso en clínica de este tipo de formulaciones en los últimos años, mostrando su eficacia y su eficiencia para el uso humano (ej. Doxil®, Ambisome ®).

Avances en el desarrollo de formulaciones para la liberación de opiáceos

La morfina se utiliza comúnmente para el tratamiento del dolor. De esta manera, sigue siendo un principio activo con el que se sigue investigando y diseñando nuevas formulaciones para ser empleado como analgésico, reduciendo la posología, mejorando la estabilidad en plasma y reduciendo efectos secundarios, para alcanzar un adecuado efecto terapéutico.

Se sabe que la administración parenteral de morfina provee de analgesia por al menos 4 h en humanos, sin embargo, provoca graves efectos secundarios como la depresión respiratoria e hipotensión. Por lo tanto, sería de gran interés que las nuevas formulaciones alcancen efectos más prolongados y también más seguridad. La encapsulación de morfina debería de suplir estas necesidades.

Recientemente, se han desarrollado novedosos sistemas de liberación de morfina. Por ejemplo, Wolf y cols. realizaron un estudio sobre la biocompatibilidad de aplicar la morfina junto con NPs sólidas lipídicas vacías para reducir el tratamiento del dolor. Betbeder y cols. mostraron que la presencia de NPs a una determinada dosis, administradas conjuntamente con morfina en ratones, incrementaba la actividad nasal analgésica. Kim y cols. desarrollaron una formulación de liposomas con morfina encapsulada para prolongar la analgesia, disminuyendo los efectos tóxicos, comparando con la libre tras la administración epidural. Además, en los últimos años se ha aprobado

115

una formulación de MLV para la administración epidural de morfina por la FDA, Depo- Dur®, que se administra en una sola dosis y permite la analgesia hasta 48 h.

Dependiendo de las propiedades farmacocinéticas de diferentes drogas hace que tengan una cierta influencia en su acción y más aún efectos en el proceso adictivo. La farmacocinética determina la velocidad con la que la droga accede al cerebro y también la duración de su acción. Determina las dosis, rutas de administración y frecuencia de uso del fármaco para alcanzar dosis seguras y efectivas. Según Koob y col. cuando se compara la farmacocinética de diferentes drogas, como por ejemplo, cocaína y metanfetamina, se puede ver que ambas alcanzan el cerebro rápidamente (aunque la cocaína es aún más rápida), siendo la cocaína la que se elimina más rápidamente del cerebro que las anfetaminas. Sin duda, la gran barrera a resolver que tenemos actualmente sobre los opioides para uso crónico, es separar en cierto modo el poder analgésico del potencial adictivo.

116

OBJETIVOS

Es bien conocido que cuanto más rápido accede una droga al SNC, su potencial adictivo es mayor. Tradicionalmente se ha pensado que puede ser debido a las propiedades euforogénicas o reforzantes de la droga aunque sería necesario profundizar más en este aspecto. Los opioides, como la morfina y derivados, son substancias con una gran habilidad para inducir la adicción. Por otra parte, los liposomas y las nanopartículas son formulaciones que producen una liberación controlada de fármaco, aunque estos sistemas transportadores han sido estudiados durante décadas para el tratamiento del dolor, se sabe muy poco sobre los efectos que conlleva la encapsulación de morfina en el proceso adictivo.

El principal objetivo de este trabajo, fue la síntesis y el estudio de diferentes sistemas de liberación de fármacos para la encapsulación de morfina, y posteriormente el estudio celular y molecular de las neuroadaptaciones moleculares que se producen en el sistema de recompensa y en el sistema del estrés durante la dependencia y síndrome de abstinencia a morfina tras la administración de estos sistemas transportadores. Con esta finalidad, fueron sintetizadas diferentes formulaciones de morfina y optimizadas para incrementar la liberación prolongada y reducir en cierto modo la velocidad con la que la droga alcanza el cerebro. Las formulaciones sintetizadas fueron MLV, PEG-L y NPs.

Objetivos específicos:

1. Las formulaciones de NPs de PLGA se emplean con frecuencia como sistemas para prolongar la liberación de fármaco por su alta biocompatibilidad y

117

biodegradabilidad. En el presente trabajo, morfina HCl fue encapsulada a través de NPs de PLGA, optimizándose su proceso de síntesis para mejorar su estabilidad y su capaciad de encapsulación.

2. Los liposomas han sido ampliamente estudiados como potenciales transportadores para su administración i.p. debido a que son capaces de permanecer durante largos periodos de tiempo en el peritoneo en comparación con el fármaco libre. Nuestro siguiente objetivo consistió por lo tanto en la formulación y caracterización de dos formulaciones de liposomas (MLV y PEG- L), el análisis de la farmacocinética así como comparar la estabilidad de ambas formulaciones y la influencia de las modificaciones superficiales en la estabilidad de los liposomas unilamelares.

3. En el siguiente objetivo nos planteamos el estudio de la analgesia en ratones a través del test en “hot plate” plato caliente, para evaluar las propiedades analgésicas que presentaban los dos tipos de liposomas estudiados (MLV y PEG-L) comparándolo con la morfina libre a varias dosis.

4. Con la finalidad de evaluar los efectos en el proceso adictivo de la morfina encapsulada respecto a la droga libre, así como las diferencias en el proceso reforzante de las drogas se realizó un estudio de comportamiento de preferencia de plaza condicionada, CPP en ratones, en los que las propiedades reforzantes de un fármaco, inicialmente relacionadas con un estímulo ambiental adquiera propiedades motivacionales de atracción, cuando el animal es posteriormente expuesto.

118

5. Nuestro siguiente objetivo consistió en evaluar los cambios inducidos durante la dependencia de morfina y síndrome de abstinencia en el sistema de recompensa según el modo de administración de la droga. Para este fin, se midió en primer lugar la DA y su metabolito DOPAC, así como NA y su metabolito MHPG en el Nacc para determinar DA y NA turnover respectivamente. Además examinamos la activación de las neuronas dopaminérgicas midiendo los receptores D1 y D2 en Nacc, y el receptor D2 en VTA. Finalmente se estudió también los cambios en BDNF en Nacc.

6. Siguiendo con los objetivos expuestos anteriormente, se analizó el papel de la encapsulación de morfina en el síndrome de abstinencia estudiando la activación del eje HPA midiendo niveles plasmáticos de corticosterona. Se sabe que la adicción comparte con el estrés mecanismos moleculares por factores neurotróficos, de esta manera se evaluó el BDNF en CeA, BNST utilizando la técnica de western blot. También se estudió la activación de neuronas dopaminérgicas para los receptores D1 en el CeA.

119

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en ésta tesis nos permite realizar las siguientes conclusiones.

1. Nuestros resultados muestran que las NPs encapsuladas por el método de DESD-AL presentaron un mayor porcentaje de encapsulación de morfina. El tiempo de sonicación reduce el tamaño pero no tiene un efecto significativo en el porcentaje de encapsulación. Además se observó que las NPs eran más estables cuando se utilizó Pluronic F68 para su síntesis en lugar de PVA. Los ensayos in vitro mostraron mejores resultados con bajas concentraciones de surfactantes en ambos casos. Cuando las NPs fueron liofilizadas y después rehidratadas, las propiedades fisicoquímicas cambiaron ligeramente pero no se apreció ninguna señal de precipitación o agregación. Finalmente, las NPs obtenidas mejoran la biodisponibilidad de la morfina obteniéndose una liberación más lenta que tras su administración de forma libre.

2. Se sintetizaron dos formulaciones de liposomas para la liberación prolongada de morfina en plasma. Se utilizó un gradiente de amonio para cargar la morfina en ambos tipos de liposomas alcanzando mayores niveles de encapsulación. Las formulaciones presentan una analgesia mucho más duradera que cuando se administra la forma libre, lo que explica la liberación más lenta del fármaco a través de los liposomas observándose también a través de los experimentos in vitro. Los estudios de analgesia se correlacionan con los de farmacocinética para ambos tipos de liposomas. Además, estas formulaciones reducieron las propiedades reforzantes de la

120

droga tras los estudios de comportamiento de preferencia de plaza (CPP), lo que mantiene la idea de que la encapsulación del fármaco reduce la adicción. 3. Se sabe que el síndrome de abstinencia a morfina conduce a una activación del eje HPA de la respuesta de estrés con un aumento de corticosterona. Los datos actuales revelan que no se antagoniza el síndrome de abstinencia que induce la activación del eje por la encapsulación de morfina en MLV ya que no se observan cambios no significativos en los niveles de corticosterona. 4. MLV atenúa el turnover de DA y NA en el Nacc durante el síndrome de

abstinencia Esto sugiere un papel en la liberación de morfina encapsulada en los neurotransmisores de DA y NA que inervan el Nacc.

5. La encapsulación de morfina afecta a la expresión de los receptores de D1 y D2 en el sistema de recompensa mesolímbico, el cual, puede estar conectado a los cambios observados en el turnover de DA y NA en el Nacc tras la administración de los liposomas.

6. Por último, se ha demostrado que tanto el BDNF como su cascada de señales alteran la función de las neuronas del circuito de VTA-Nacc y otras regiones del sistema de recompensa que modulan la motivación para el consumo de drogas. Los resultados obtenidos en el presente trabajo, muestran una desregulación en la función del síndrome de abstinencia en Nacc mientras que no se observan diferencias significativas en BNST y CeA.

Podemos concluir que este estudio provee de novedosos datos sobre la nanotecnología para la administración de fármacos que representa una posible aplicación para tratar la adicción a drogas alterando el sistema de recompensa y los efectos aversivos del síndrome de abstinencia.

121

BIBLIOGRAPHY

ABREGO, G., ALVARADO, H. L., EGEA, M. A., GONZALEZ-MIRA, E., CALPENA, A. C. & GARCIA, M. L. 2014. Design of nanosuspensions and freeze-dried PLGA nanoparticles as a novel approach for ophthalmic delivery of pranoprofen. J Pharm Sci, 103, 3153-64.

ALMELA, P., NAVARRO-ZARAGOZA, J., GARCIA-CARMONA, J. A., MORA, L., HIDALGO, J., MILANES, M. V. & LAORDEN, M. L. 2012. Role of corticotropin-releasing factor (CRF) receptor-1 on the catecholaminergic response to morphine withdrawal in the nucleus accumbens (NAc). PLoS One, 7, e47089.

ALLISON, S. D. 2008. Analysis of initial burst in PLGA microparticles. Expert Opin Drug Deliv, 5, 615-28.

ARMARIO, A. 2010. Activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis by addictive drugs: different pathways, common outcome. Trends Pharmacol Sci, 31, 318-25.

BALI, A., RANDHAWA, P. K. & JAGGI, A. S. 2015. Stress and opioids: role of opioids in modulating stress-related behavior and effect of stress on morphine conditioned place preference. Neurosci Biobehav Rev, 51, 138-50.

BANNON, A. W. & MALMBERG, A. B. 2007. Models of nociception: hot-plate, tail-flick, and formalin tests in rodents. Curr Protoc Neurosci, Chapter 8, Unit 8 9.

BARENHOLZ, Y. 2012. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. J Control

Release, 160, 117-34.

BARENHOLZT, Y., AMSELEM, S. & LICHTENBERG, D. 1979. A new method for preparation of phospholipid vesicles (liposomes) - French press. FEBS Lett, 99, 210-4.

BEAULIEU, J. M. & GAINETDINOV, R. R. 2011. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev, 63, 182-217.

BETBEDER, D., SPERANDIO, S., LATAPIE, J. P., DE NADAI, J., ETIENNE, A., ZAJAC, J. M. & FRANCES, B. 2000. Biovector nanoparticles improve antinociceptive efficacy of nasal morphine. Pharm Res, 17, 743-8.

BIAN, X., LIANG, S., JOHN, J., HSIAO, C. H., WEI, X., LIANG, D. & XIE, H. 2013. Development of PLGA-based itraconazole injectable nanospheres for sustained release. Int J

Nanomedicine, 8, 4521-31.

BOLANOS, C. A. & NESTLER, E. J. 2004. Neurotrophic mechanisms in drug addiction.

Neuromolecular Med, 5, 69-83.

BRUIJNZEEL, A. W. 2012. Tobacco addiction and the dysregulation of brain stress systems.

Neurosci Biobehav Rev, 36, 1418-41.

CAINE, S. B., HEINRICHS, S. C., COFFIN, V. L. & KOOB, G. F. 1995. Effects of the dopamine D-1 antagonist SCH 23390 microinjected into the accumbens, amygdala or striatum on cocaine self-administration in the rat. Brain Res, 692, 47-56.

CAINE, S. B., NEGUS, S. S., MELLO, N. K., PATEL, S., BRISTOW, L., KULAGOWSKI, J., VALLONE, D., SAIARDI, A. & BORRELLI, E. 2002. Role of dopamine D2-like receptors in cocaine self- administration: studies with D2 receptor mutant mice and novel D2 receptor antagonists. J Neurosci, 22, 2977-88.

CAINE, S. B., THOMSEN, M., GABRIEL, K. I., BERKOWITZ, J. S., GOLD, L. H., KOOB, G. F., TONEGAWA, S., ZHANG, J. & XU, M. 2007. Lack of self-administration of cocaine in dopamine D1 receptor knock-out mice. J Neurosci, 27, 13140-50.

122

CARBONI, E. & VACCA, C. 2003. Conditioned place preference. A simple method for investigating reinforcing properties in laboratory animals. Methods Mol Med, 79, 481- 98.

CLERC, S. & BARENHOLZ, Y. 1995. Loading of amphipathic weak acids into liposomes in response to transmembrane calcium acetate gradients. Biochim Biophys Acta, 1240, 257-65.

COBOS, E. J. & PORTILLO-SALIDO, E. 2013. "Bedside-to-Bench" Behavioral Outcomes in Animal Models of Pain: Beyond the Evaluation of Reflexes. Curr Neuropharmacol, 11, 560-91. COHEN-SELA, E., CHORNY, M., KOROUKHOV, N., DANENBERG, H. D. & GOLOMB, G. 2009a. A

new double emulsion solvent diffusion technique for encapsulating hydrophilic molecules in PLGA nanoparticles. J Control Release, 133, 90-5.

COHEN-SELA, E., TEITLBOIM, S., CHORNY, M., KOROUKHOV, N., DANENBERG, H. D., GAO, J. & GOLOMB, G. 2009b. Single and double emulsion manufacturing techniques of an amphiphilic drug in PLGA nanoparticles: formulations of mithramycin and bioactivity. J

Pharm Sci, 98, 1452-62.

COOPER, D. L. & HARIRFOROOSH, S. 2014. Design and optimization of PLGA-based diclofenac