El sitio de unió de Ca 2+ también sirve como sitio de unión del H + intracelular

potencial del campo eléctrico puede generar cambios estructurales que induzcan la apertura del canal. Se ha sugerido que la dependencia con el Vm proviene del pegado del Ca2+ _{a su sitio de unión.}

El sitio de unión a Ca2+ _{está formado por los residuos N650, E654, E702, E705,} E734 y E738. Cuando se reemplazan los dos Glu, E702 y E705, por glutaminas, la sensibilidad del canal por Ca2+ _{disminuye desde nM hasta mM (151).}

El sitio de unión de calcio cuenta con 4 aminoácidos cargados negativamente que se localizan dentro la membrana donde detecta aproximadamente el 12-15% del campo eléctrico. Por esta razón, ante un cambio en el potencial, estos aminoácidos podrían moverse y permitir que el canal se abra parcialmente.

Para eliminar la dependencia con Vm debido al pegado de Ca2+ _{y para evaluar el} comportamiento de estos residuos ante un cambio en el potencial, se mutaron los residuos E702 y E705 a glutaminas. Este cambio elimina la carga de estos residuos por lo que ya no podrían reaccionar a cambios en el Vm. Además, la probabilidad de que el calcio se una a ese sitio ahora es muy baja.

En la Figura 6-6A se observan trazos representativos de las corrientes obtenidas de dos células HEK-293 transfectadas con el canal TMEM16A-E702Q-E705Q y dializadas una con una solución que contiene 25.24 mM de EGTA/0Ca2+ _{(arriba) y} la otra dializada con una solución que contiene 25.24 mM de EGTA y 0.2 mM Ca2+ (abajo). Las células se estimularon usando el protocolo de activación (Figura 3-4A). La cinética de ICl,Vm es muy similar en ambos casos. El canal se activa rápidamente, se mantiene constante la corriente durante el estímulo y después el canal cierra muy

100

rápido y en ninguna condición se observó corriente de cola. La amplitud de ICl,Vm es similar en presencia y ausencia de Ca2+ _{(Figura 6-6B).}

Debido a que no hay cambio en la activación por Vm con el canal silvestre, estos resultados sugieren que el sitio de pegado de calcio no participa en la dependencia con el Vm cuando el canal se activa por Vm en ausencia de Ca2+_.

Con la finalidad de identificar cuales residuos negativos (Glu o Asp) dentro del sitio de unión de Ca2+ _{son blanco del H}+ _{intracelular, se cambiaron los residuos de} manera sumatoria (4 Glu y 1 Asp). Estos residuos se mutaron a Gln para simular un Glu con la cadena lateral permanentemente protonada.

Por otro lado, si el H+ _{neutraliza el grupo COO}- _{del Glu o Asp para activar el canal} TMEM16A WT entonces el Vm activaría las mutantes a Gln a pHi=7.3.

La Figura 6-7 muestra los registros de ICl,Vm a -100, -40, +20, +60, +120 y +160 mV de cinco células independientes que expresan los canales (de arriba hacia abajo): silvestre, E702Q-E705Q (2M), E702Q-E705Q-E734Q (3M), E702Q-E705Q-E734Q-

Figura 6-6 Activación por voltaje y por Ca2+ _{de la mutante TMEM16A-E702Q-E705Q. A Trazos}

representativos de dos células HEK-293 que expresan el canal TMEM16A-E702Q-E705Q y que fueron dializadas una con una solución con 25.24 mM EGTA/0Ca2+ _{y otra con 25.24 mM EGTA y 0.2 µM Ca}2+_{. Las}

células fueron estimuladas con el protocolo de activación mostrado en la figura 3-4A. [Cl-_]

e/[Cl-]i=140/40 mM.

B Relación Densidad de Corriente en función de Vm del canal TMEM16A-E702Q-E705Q activado con 0.2

101

D738Q (4M) y E654-E702Q-E705Q-E734Q-D738Q (5M). Todas las células se dializaron con 25.24 mM EGTA/0 Ca2+ _{y pHi 7.3.}

Conforme en número de mutaciones incrementa, la magnitud de ICl,Vm aumenta imitando el efecto de la acidificación intracelular (Figura 6-7). La ICl,Vm al inicio fue rápida y constante durante el estímulo y no se observaron corrientes de cola cuando se repolarizó a -100 mV. Una rápida corriente de cola se observó solamente con la 5M (ver la maximización panel inferior izquierdo).

La correspondiente curva ICl,Vm-Vm muestra rectificación saliente como el canal silvestre, sin embargo, el patrón de rectificación en las mutantes es variable y no parece tener un patrón particular (Figura 6-7A columna de la derecha). Aunque la magnitud de la ICl,Vm incrementa a todos los Vm a +160 en el caso de la 5M se observa una aparente saturación de la corriente.

A pHi=7.3 una fuerte despolarización (+160 mV) induce un incremento de ICl,Vm de 6.5 veces en el canal 5M comparado con el silvestre (Figura 6-7B).

Los datos anteriores muestran que mutar los residuos ácidos del sitio de unión de Ca2+ _{a Gln permite la activación de TMEM16A a pHi=7.3 en ausencia de Ca}2+ intracelular.

Si estos residuos son la principal fuente de sensibilidad con el Vm, se puede suponer que bajo condiciones acídicas debería tener un pequeño o nulo efecto en la ICl,Vm y la dependencia con el Vm de pKa ya no debería existir. Para probar esto, se registraron la ICl,Vm de células dializadas con una solución intracelular a pHi=4. La Figura 6-8 muestra registros de ICl,Vm para los canales silvestre, 2M, 3M, 4M y 5M (arriba a abajo). La cinética de las ICl,Vm a pHi 4.0 y 7.3 (comparando 6-7A con 6-8A) fue muy similar. Por ejemplo, a +160 mV la constante de tiempo de activación para el canal 5M fue 0.46 ± 0.04 ms (n=5) a pHi 7.3 y 0.77 ± 0.03 ms (n=5) a pHi 4.0. Las correspondientes curvas ICl,Vm-Vm muestran menor rectificación (Figura 6- 8A panel derecho).

102

Figura 6-7 Mutar los residuos ácidos que forman el sitio de unión de Ca2+ _{potencia la activación por} Vm de TMEM16A en condiciones de pHi fisiológicas. A Registros representativos de ICl,Vm (izquierda)

obtenidos de diferentes células que expresan los canales (arriba-abajo) WT (n = 8), 2M (n = 5), 3M (n = 6), 4M (n = 6), and 5M (n = 6) y sus correspondientes curvas ICl,Vm (derecha). Nótese la ausencia de corriente

de cola en esos registros (amplificación: Corriente de cola de la mutante 5M). En todos los registros: [Cl−]e/[Cl−]i = 140/40 mM, pHe/pHi = 7.3/7.3 y [Ca2+]i = 0. B Densidad de corriente vs el número de residuos

103

Los valores de potencial de inversión para el silvestre, 2M, 3M, 4M y 5M fueron −31.4 ± 0.8, −31.5 ± 0.7, −29.2 ± 0.7, −31.0 ± 2.1 y −28.0 ± 0.9 mV respectivamente. Esto indica que a pHi 4.0 la ICl,Vm se generó por flujo de Cl-_.

Sin embargo, a pHi 4.0 la magnitud de ICl,Vm (registrada a Vm positivos) incrementa conforme incrementa el número de mutaciones en el sitio de pegado de Ca2+ _(Figura 6-8B). Aunque, este incremento es mucho menor en la 5M comparado con la versión silvestre del canal.