SOBREEXPRESIÓN CONJUNTA DE LOS GENES DE CADA SISTEMA

Una vez corroborado que, por un lado, la deleción de los genes abrA1/A2 causaba un efecto positivo global sobre producción de antibióticos y diferenciación y que por otro lado la deleción de los genes abrC1/C2/C3 repercutía negativamente en ambos procesos, se propuso estudiar el efecto de la sobreexpresión de los genes integrantes de cada TCS en conjunto (HK(s)+RR).

Con esta finalidad, se construyeron plásmidos de sobreexpresión con los genes de interés derivados del pN702GEM3 (Díaz et al., 2005), un vector de alto número de copias bifuncional

E. coli-Streptomyces. En el caso del sistema abrA1/A2, la pareja de genes se clonaron bajo el

control del promotor de la xilanasa xysA, un promotor fuerte e inducible por xilosa y xilano (Rodríguez et al., 2005) dando como resultado el plásmido pNXabrA1A2. Con respecto al sistema abrC1/C2/C3, debido a que los genes que lo constituyen no parecen formar una unidad transcripcional, se decidió clonar el fragmento formado por los tres genes y sus respectivas regiones intergénicas en el plásmido multicopia pN702GEM3 generando el plásmido pNabrC1C2C3. La construcción de ambos plásmidos se detalla en materiales y métodos, 3.

Para evaluar el efecto de la sobreexpresión del sistema abrA1/A2, se transformó la cepa mutante ∆abrA1/A2 con el plásmido que sobreexpresaba los sistemas abrA1/A2 (pNXabrA1A2) y con el vector parental (pN702GEM3) como control. A su vez, para ver el efecto multicopia del sistema abrC1/C2/C3 se transformó el mutante ∆abrC1/C2/C3 con el plásmido pNabrC1C2C3 y con el control pN702GEM3. Además también se transformó la cepa wt con el plásmido pN702GEM3 para poder comparar fenotipos. Tal y como se había hecho con las cepas mutantes y revertientes se repitieron los estudios fenotípicos en medio sólido.

3.1.1. Análisis fenotípico de la sobreexpresión del sistema abrA1/A2

Tras la obtención de esporas de las cepas wt.pN702GEM3, ∆abrA1/A2.pN702GEM3 y la ∆abrA1/A2.pNXabrA1A2, se inocularon cantidades equivalentes en diferentes medios de cultivo suplementados con neomicina (20 µg/ml). Por un lado se sembraron dichas cepas en sectores en medio NMMP, para comparar tanto la producción de actinorrodina (vista inferior de la placa) como la diferenciación (vista superior). Por otro lado se inocularon 103 esporas por gota (5 µl) en medio PGA para analizar la producción de undecilprodigiosina y en AN para

realizar los bioensayos con B. subtilis que permiten detectar la producción de CDA. También se analizó la diferenciación mediante un ensayo en gota idéntico al anterior, en medio NMMP. Los resultados obtenidos se muestran en la figura R.12.

A.

B.

Figura R.12. Ensayo de sobreexpresión del sistema abrA1/A2. Cepas utilizadas: M145.pN702GEM3,

∆abrA1/A2.pN702GEM3 y ∆abrA1/A2.pNXabrA1A2. (A) Cepas sembradas en sectores en placas NMMP+neo 20 µg/ml. Diferenciación visible en la parte superior de la placa y producción de actinorrodina en la parte inferior (B) Producción de CDA en AN + Ca(NO3)2 (60 mM) (B.1), producción de undecilprodigiosina (RED) en medio PGA+neo 20 µg/ml (B.2) y diferenciación en NMMP+neo 20 µg/ml (B.3).

La sobreexpresión del sistema abrA1/A2 eliminaba el efecto de aceleración en la diferenciación de la cepa mutante carente de los genes, revertiéndose el fenotipo presentado por la cepa mutante (figura R.12.A y 12.B.3) lo que confirmaba de nuevo el papel negativo de los genes de este sistema regulador sobre los procesos de diferenciación. Respecto a la producción de antibióticos no sólo se suprimía el efecto hiperproductor de actinorrodina observado en la cepa mutante ∆abrA1/A2, si no que la biosíntesis de ACT quedaba anulada cuando la cepa ∆abrA1/A2 sobreexpresaba el sistema. Además, como cabía esperar, el efecto no era exclusivo de la biosíntesis de actinorrodina, si no que la producción de CDA y de undecilprodigiosina

Resultados

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∆abrA1/A2.pNXabrA1/A2, incluso por debajo de los niveles de producción de la cepa silvestre. Estos experimentos son una evidencia más de que el TCS formado por los genes abrA1/A2 es un regulador negativo pleiótropico y que su acción afecta tanto de la producción de los tres antibióticos producidos por S. coelicolor M145 como a su desarrollo morfológico.

3.1.2. Análisis fenotípico del sistema abrC1/C2/C3 en multicopia

De la misma manera que en el apartado anterior, cantidades idénticas de esporas de las cepas wt.pN702GEM3, ∆abrC1/C2/C3.pN702GEM3 y ∆abrC1/C2/C3.pNabrC1C2C3, se sembraron en sectores y en gota en los medios AN y PGA suplementados con neomicina (20 µg/ml). A continuación se analizó de nuevo la producción de los tres antibióticos en las cepas en estudio así como la diferenciación. Los resultados obtenidos se resumen en la figura R.13.

A.

B.

Figura R.13. Fenotipos del sistema abrC1/C2/C3 en multicopia. Cepas ensayadas: M145.pN702GEM3, ∆abrC1/C2/C3.pN702GEM3 y ∆abrC1/C2/C3.pNabrC1C2C3. (A) Cepas sembradas en sectores en placas AN+neo 20µg/ml crecidas durante 3 días. Diferenciación visible en la parte superior de la placa y producción de actinorrodina en la parte inferior. (B) Producción de CDA en medio AN + Ca(NO3)2 (60 mM) (B.1), producción de undecilprodigiosina (RED) en medio PGA+neo 20 µg/ml (B.2) y diferenciación en AN+neo 20 µg/ml (B.3).

Tal y como se aprecia en las fotografías, el efecto del sistema abrC en multicopia en la cepa mutante ∆abrC1/C2/C3, no solo no restauraba el fenotipo silvestre con una producción normal de antibióticos, sino que sorprendentemente originaba una inhibición de la producción de actinorrodina más drástica que en su deleción. En cuanto a la producción de CDA y RED, el efecto de incrementar la dosis génica era similar al que causaba la deleción del sistema, viéndose ambos antibióticos reducidos en las dos situaciones. El efecto sobre la diferenciación, no obstante, era el esperado en inicio, la cepa mutante portadora del plásmido multicopia aceleraba la diferenciación superando los niveles de la cepa wt (se aprecia por el color blanquecino del micelio) (figura R.13.A y R.13.B). Los mismos fenotipos se obtuvieron al introducir el plásmido pNabrC1C2C3 en la cepa silvestre S. coelicolor M145 (datos no mostrados) lo que excluía la posibilidad de algún efecto polar de la cepa mutante sobre la expresión de los genes en el plásmido multicopia.

Debido al inesperado efecto descrito cuando se aumentaba el número de copias del sistema abrC1/C2/C3 utilizando como vector el pN702GEM3 (derivado del pIJ702, 40-100 copias (Katz, 1983), se quiso evaluar qué ocurría si se clonaba el mismo inserto formado por las regiones codificantes y promotoras de los genes abrC1/C2/C3 en un plásmido de bajo número de copias. Para ello, se utilizó el vector pHJL401 (derivado del SCP2, 5-10 copias por genoma (Larson, 1986) y al plásmido resultante se le denominó pHJLabrC1C2C3 (materiales y métodos, 3). Tras la transformación de las cepas wt y ∆abrC1/C2/C3 con el plásmido vacío y con el pHJLabrC1/C2/C3 y la posterior purificación de las esporas, se sembraron las cepas en sectores en medio AN para observar la producción de actinorrodina. Los resultados (figura R.14.) demostraron el efecto positivo del sistema abrC sobre la producción de ACT tanto en la cepa

∆abrC1/C2/C3 (mitad izquierda de las placas) como en la wt (mitad derecha de las placas).

Figura R.14. Producción de ACT en las cepas ∆abrC1/C2/C3.pHJL401, M145.pHJL401, ∆abrC1/C2/C3.pHJLabrC1C2C3 y wt.pHJLabrC1C2C3 sembradas en sectores en placas AN+tsr 10 µg/ml crecidas durante 3 días.

Resultados

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Se quiso evaluar también el efecto de la reducción del número de copias del sistema

abrC1/C2/C3 sobre la producción de undecilprodigiosina y CDA. Los resultados obtenidos

fueron similares a aquellos derivados del pN702GEM3 (resultados no mostrados), por lo que el efecto negativo de la deleción del sistema y del incremento del número de copias del mismo sobre los antibióticos undecilprodigiosina y CDA era equivalente.

Del conjunto de resultados anteriores, se puede concluir: (1) que el sistema abrC1/C2/C3 necesita estar en una dosis génica adecuada para que el proceso de producción de actinorrodina tenga lugar satisfactoriamente, inhibiéndose con un elevado número de copias de los genes, (2) cuando se aumenta el número de copias del sistema abrC o por el contrario se eliminan los genes, el efecto sobre la producción de undecilprodigiosina y CDA es negativo en todos los casos y (3) el efecto ejercido por el sistema abrC1/C2/C3 sobre la diferenciación cuando se encuentra en multicopia es positivo y la deleción decelera el proceso. Esto indica que ambos procesos, producción de antibióticos y diferenciación, aún siendo regulados por el mismo TCS, siguen distintas vías de señalización.