Soluciones y medios para el análisis y cultivo celular

Los medios utilizados para la realización de las diferentes pruebas de laboratorio se describen en orden, con base a la realización de los experimentos.

Tabla 7. Reactivos para la realización de pruebas de laboratorio.

Prueba Casa comercial Prueba Casa comercial Determinación de Fragmentación de ADN Medios de fecundación in vitro

Agua destilada Agua bidestilada Sigma

Etanol Panreac BSA (bovine serum

albumin) Kit Sperm-Sus- Halomax ChromaCell,SL. Madrid BTS Yoduro de propidio Invitrogen, Carlsbad Cafeína Sigma

Antifaiding Cl2Ca-2H2O Sigma

KCl

Determinación de Zn en tejidos, PS y SE* NaCl

Agua desionizada SETNA Cl2Mg-6H2O

HCl 37% PANRREAC CO3Hna Sigma

Solución patrón 1000 ppm de Zn

PANRREAC D-L Ácido láctico Sigma

Glucosa Sigma

Evaluación seminal Hipotaurina Sigma

Agua destilada Hoescht-33342 Sigma

Agua desionizada Kanamicina

Agua Milli-Q Millipore KH2PO4 Sigma

Citrato de sodio Lacmoid Sigma

Formol L-Glutamina Sigma

Glucosa Na2HPO4 Sigma

Isocintao de Fluoreceina

Sigma NaCl Sigma

KCl Sigma DABCO Sigma

Lectina PSA Penicilina G potásica Sigma

NaHCO3 Sigma Piruvato de sodio Sigma

Na·EDTA·2H2O Sigma PO4H2K Sigma

Rosa de bengala SO4Mg·7H2O Sigma

Sulfato de Estreptomicina Sigma

Taurina Sigma

Tris Sigma

Vectashield Vector

Laboratories, Inc *AOAC, 2000.

MATERIAL Y MÉTODOS

3.1.5.1. Diluyente BTS

El medio BTS fue realizado en el laboratorio de Reproducción del Departamento de Fisiología Animal de la Universidad Complutense de Madrid (Tabla 8). El BTS fue utilizado para la dilución de la FR, conservación y transporte de las muestras para las pruebas de IF y FIV.

Tabla 8. Diluyente BTS para semen de verraco.

BTS = Beltville Thawing Solution. Fuente: Pursel y Johnson, 1975.

3.1.5.2. Solución salina formolada

Se disolvieron 9 gr de Cloruro sódico en 1000 mL de agua destilada y 3 mL Formaldehído. Hasta su utilización, esta solución fue almacenada a temperatura ambiente.

3.1.5.3. Solución PSA-FICT

La lectina Pisum sativum (PSA) fue diluida en agua ultrapura Milli-Q en una relación 1:20 con Fluoresceína-5-Isotiocinato (FITC).

3.1.5.4. Solución DABCO

Un gramo de 1,4-Diazabyciclo-[2.2.2] Octano (DABCO): Triethylenediamina, fue mezclado en una solución de glicerol con agua destilada en una relación 1/9. Ingredientes Concentración (mM) Glucosa 0,0002 Na·EDTA·2H2O 3,36 NaHCO3 20 KCl 5

3.1.5.5. Medio para la recolección y lavado de ovarios

El medio utilizado para la recolección de ovarios desde el matadero hasta el laboratorio, fue realizado con solución salina (0.9% NaCl) adicionado con 70 µg mL-1 de Kanamicina y atemperado a 38ºC.

La solución salina fue utilizada para lavar los ovarios dos veces, hasta seleccionar los folículos adecuados para su punción con una aguja de 18G, conectada a una jeringuilla de 10 mL.

3.1.5.6. Medio para lavado de ovocitos

Los ovocitos fueron lavados con una solución PBSDm (Solución fosfatada tamponada de Dulbecco modificada) (Tabla 9) suplementada con BSA (albúmina de suero bovino) en el momento de su utilización.

Tabla 9. Composición de la solución PBS*.

Reactivo Concentración (mM)

NaCl 136.89 KCl 2.68

Na2HPO4 10.14

KH2PO4 1.76

*PBS= Solución fosfatada tamponada.

3.1.5.7. Medio para lavado de espermatozoides

Los espermatozoides fueron lavados y manipulados con la solución PBSDm adicionada con 2 mg mL-1 de BSA. La solución fue filtrada posteriormente.

3.1.5.8. Medio de fecundación

La composición del MF utilizado para la fecundación in vitro se observa en la Tabla 10. Previo a su utilización, se agregaba cafeína (2 mM) y 0.2% de BSA, a continuación, se incubaba 40 h ajustando el pH a 7.4. Una vez transcurrido este periodo de equilibrio, el medio fue filtrado para su utilización.

MATERIAL Y MÉTODOS

Tabla 10. Medio de fecundación (MF).

Reactivo Concentración (mM) NaCl 113.1 KCl 3.0 Cl2Ca·2H2O 7.5 Tris 20 Glucosa 11 Piruvato de sodio 5 3.1.5.9. Solución de Lacmoid

Se disolvió 1 g de Lacmoid en 45 mL de agua bidestilada. Se calentó hasta el punto de ebullición. Una vez que alcanzó la temperatura ambiente, se fue añadiendo ácido acético glacial, hasta una cantidad de 45 mL. Se almacenó en un lugar fresco y oscuro.

Antes de su utilización, se filtraba la cantidad necesaria para la evaluación de los ovocitos fecundados.

3.1.5.10. Fluorocromo

Se mezcla en una relación 1:1 (v/v) el Yoduro de propidio y antifading.

3.1.5.11. Solución de ácido clorhídrico (HCl18.5%)

En la campana de extracción se mezcló 500 mL de agua desionizada, con 500 mL de HCl al 37%. Se dejó reposar y se almacenó a temperatura ambiente.

3.2. Instalaciones

Para cumplir con los objetivos planteados en esta investigación, se utilizó una nave cerrada, con ventilación automática para la época de calor. Las jaulas para los verracos fueron individuales, con bebedero de chupete, comedero de canaleta y sistema automático para el suministro del pienso. Suelo enrejillado dispuesto encima de la fosa de deyecciones.

El área de trabajo para la extracción seminal fue acondicionada dentro de la misma nave, en una superficie de 2.5 x 2.5 m. Se dispuso de un maniquí para la monta, y una alfombra antideslizante, para facilitar la actividad de los verracos.

En la misma granja se acondicionó un laboratorio para realizar los análisis de contrastación seminal, y elaboración de las muestras necesarias para los experimento 2, 3 y 4.

El Experimento 2 y parte del Experimento 5 se desarrolló en el laboratorio de la Unidad Docente de Zoología (UDZ), Dpto. de Fisiología, de la Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid. El Experimento 3, fue realizado en el Laboratorio de Genética de la Facultad de Ciencias, de la Universidad Autónoma de Madrid. El Experimento 4, fue llevado a cabo en el laboratorio de Reproducción del Hospital de Enseñanza Veterinaria de la Universidad de Murcia.

Para la realización del Experimento 5, los verracos fueron sacrificados en el matadero frigorífico ESFOSA, Vic, en Barcelona, recuperando los testículos y epidídimos. Los análisis de MS, humedad (H) y cenizas (C), de dichos órganos se realizaron en el laboratorio de Producción Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid. Todas las muestras del experimento 5 fueron llevadas al laboratorio de Análisis y Control de Calidad de Materias Primas y Piensos del Grupo SETNA Nutrición, S.A. en Madrid.