Subclonación de los productos de la PCR

8.2.4.1. Ligación de los productos de PCR en el vector pGEM-T® _{Easy.Los productos de la} PCR se ligaron en el vector pGEM-T® Easy (Figura 7) usando el sistema de ligación del vector pGEM-T® Easy II (Promega). La siguiente fórmula se usó para calcular la cantidad del producto de la PCR que sería usado en la reacción de ligación. Cada reacción contenía 25 ng del vector pGEM-T® Easy y 3 unidades de ADN ligasa T4. Las reacciones se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas y posteriormente las ligaciones se almacenaron a 4ºC.

8.2.4.2. Transformación de las células competentes de alta eficiencia JM109 con plásmidos conteniendo el fragmento de ADN. Los plásmidos se usaron para transformar las células competentes de alta eficiencia JM109, las cuales fueron proveídas dentro del sistema del vector pGEM-T® Easy II (Promega). Las células competentes se descongelaron sobre hielo. Se tomaron alícuotas de 50 µl de estas células y se depositaron en tubos de polipropileno de 15 ml Falcon 2059 (Becton Dickinson) previamente enfriados en hielo. Se adicionaron a las células 2 µl de la reacción de ligación y se dejó incubar sobre hielo durante 20 minutos. Los plásmidos fueron introducidos en las células competentes por choque térmico en baño María a 42ºC durante 50 segundos. Después de incubar los tubos en hielo durante 2 minutos, se adicionaron en cada tubo 0.950 ml de medio SOC precalentado a 42ºC (2% de bacto-triptona, 0.5% de levadura, 0.05% de NaCl y 20 mM de glucosa) y se dejaron incubar a 37ºC con agitación continua (250 rpm) durante 90 minutos. Posteriormente se sembraron 100 microlitros de las bacterias transformadas en cajas de petri con agar LB conteniendo 50 µg/ml de ampicilina y cubiertas con 100 µl de X-gal al 2% (5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactosido, Promega) y 10

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µl de 100 mM IPTG (isopropil β-D-tiogalactósido, Promega). Las cajas de petri se incubaron a 37ºC durante toda una noche.

Figura 7. Mapa y sitios de clonación del vector pGEM-T® _{Easy. El sistema} vector pGEM-T® _{Easy es un sistema usado para la clonación de productos de PCR} con una elevada eficiencia de ligación del producto en el plásmido. Este vector incluye el fragmento lacZα, lo que permite el tamizaje selectivo de colonias azules y blancas. El vector incluye genes de resistencia para ampicilina y kanamicina para selección de colonias de Eschlerichia coli transformadas.

8.2.4.3. Identificación y selección de las células bacterianas transformadas con los plásmidos recombinantes. La identificación de las colonias positivas se dio por selección de color, la cual se basa en la actividad de la enzima β-galactosidasa (lacZ) de E. coli y en la regulación del operón lactosa (Figuras 7 y 8). La enzima β-galatosidasa está formada por un dominio N-terminal (subunidad α) y otro C-terminal (subunidad ω) que al unirse presentan actividad enzimática. La actividad de esta enzima puede detectarse in vivo usando el sustrato cromogénico X-gal que toma una coloración azul intenso cuando es procesado por la enzima. Al insertarse el fragmento de ADN de interés en los plásmidos que portan la subunidad α, esta secuencia se interrumpe y la subunidad no se expresa más. Por tanto las colonias que portan los plásmidos recombinantes son de coloración blanca a diferencia de las clonas azules las cuales no recibieron el plásmido recombinante (Figura 8).

Se realizó una comprobación por PCR (screening por PCR) amplificando el inserto utilizando los cebadores específicos M13F/M13R (Tabla 8.2.1) que se unen a regiones del vector. Para ello las colonias blancas se inocularon usando puntillas estériles en cajas petri con agar LB frescas conteniendo 50 µg/ml de ampicilina, depositando una pequeña proporción en tubos estériles conteniendo la mezcla para la PCR. Las cajas se incubaron durante toda una noche a 37ºC. La reacción de la PCR consistió en 0.18 mM de MgCl2, 0.18 mM de la mezcla de

dNTP, 0.75 µM del iniciador M13 F y M13 R y 3.75 unidades de ADN polimerasa en la reacción buffer de Bioline. La reacción de la PCR se realizó a 95ºC durante 5 min seguida de 35 ciclos de 94ºC durante 30s, 55ºC durante 30s y 72ºC durante 1 min y finalmente 72ºC durante 5 min. Los productos de PCR fueron separados en un gel de agarosa al 1% para comprobar el peso molecular.

8.2.4.4. Cultivo de las colonias de transformación seleccionadas. Se seleccionaron al menos 10 colonias de bacterias de placa blanca o positivas ("no azules") para ser inoculadas con una puntilla estéril en 3 ml de medio LB conteniendo 50 µg/ml de ampicilina. Los cultivos se incubaron a 37ºC con agitación continua (250 rpm) durante toda una noche.

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Figura 8. Selección por α-complementación o por colonias blancas y azules. El Plásmido F de E. coli (arriba) contiene la subunidad ω, mientras que la subunidad α (izquierda) esta incluída en el vector pGEM-T® _{Easy. El IPTG es una molécula sintética} análoga a la alolactosa que se une eficientemente al represor del operón lactosa, convirtiéndola en un inductor del sistema.

8.2.4.5. Purificación de los plásmidos. El cultivo bacteriano (1.5 ml) se centrifugó a 13,000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Los plásmidos se extrajeron usando el kit QIAprep miniprep (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. En detalle, las pastillas de células bacterianas se resuspendieron en 250 µl de buffer P1 (buffer de resuspensión conteniendo 0.1 mg/ml de RNasa A). La lisis alcalina se realizó adicionando 250 µl de buffer P2 (buffer de lisis) y mezclando suavemente por inversión los tubos. Se adicionó el buffer de neutralización, buffer N3 (350 µl) para neutralizar el alkali e inmediatamente el tubo se invirtió suavemente de 4-6 veces. Para separar los restos celulares del supernadante conteniendo los plásmidos, la solución se centrifugó (13,000 rpm, 10 min) y el sobrenadante se transfirió a una columna QIAprep. El ADN plasmídico se unió a la columna debido a las condiciones de elevada unión salina del buffer N3. Las columnas se centrifugaron (13,000 rpm, 1 min) desechándose el filtrado. Para eliminar los contaminantes, la columna se lavó con 0.75 ml de buffer PE (buffer de unión). El ADN plasmídico se eluyó con 50 µl de agua estéril libre de DNasa (Sigma) y se dejaron reposar durante 1 minuto. Para colectar el ADN plasmídico la columna se centrifugó (13,000 rpm, 1 min). La concentración de los plásmidos se determinó usando un espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies).

8.2.5. Secuenciación y alineamiento del ADN clonado

El ADN plasmídico se secuenció en ambas direcciones usando los iniciadores M13F/M13R (Tabla 8.2.1). La secuenciación del ADN se realizó usando el método de secuenciación con tinte terminador y los productos fueron electroforesados sobre un Beckman Coulter CEQ8000. Las secuencias se analizaron usando el software DNAStar® (Lasergene) y comparadas con las bases de datos públicas (http://www.ebi.ac.uk/blastall/nucleotide.html) usando el programa BLAST con el objetivo de confirmar su identidad con secuencias relacionadas.

Para el análisis estructural de la secuencia completa de nucleótidos del gen de interés, se realizó un análisis INTERPROScan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/), el cual compara las secuencias contra un gran número de bases de datos de motivos y dominios de proteínas.