Subclonaje de CosKT12 y secuenciación de la agrupación de genes

wbKpO12

Se trató de subclonar CosKT12 en DH5α utilizando diversos plásmidos y digestiones parciales. Con la enzima PstI se clonó un fragmento de unas 13 Kb en el vector pBR328. Este subclón, al cuál denominamos pJTO12, mostraba una reacción positiva en una inmunotransferencia a nivel colonial realizada con antisuero específico contra el antígeno O12 de K. pneumoniae. Tal y como se observó por geles de LPS e inmunotrasferencia, el plásmido pJTO12 dotaba a E. coli DH5α de la capacidad de producir el antígeno O12 de K. pneumoniae (fig. 4.1, A y B). Además, el subclón fue transferido a la cepa CLM4, que carece completamente del grupo de genes wb (Marolda y Valvano, 1993), y ésta fue capaz de producir antígeno O12. Todos estos datos indicaban que pJTO12 contenía toda la información genética necesaria para la producción del antígeno O12 de K. pneumoniae.

La secuencia de ADN se inició con los cebadores pBRPstcw y pBRPstccw, que hibridan a ambos lados de la diana de restricción PstI del plásmido pBR328, lugar donde se clonó el inserto en el subclón pJTO12. El resto de la secuencia se completó mediante el diseño de nuevos cebadores a partir de la secuencia de nucleótidos que se iba obteniendo. Se determinaron un total de ocho ORFs completas que se transcribían en la misma dirección (tabla 4.1) y se localizaron posibles secuencias de unión de

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7

A

B

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7

A

B

Fig. 4.1. (A) SDS-PAGE teñido con nitrato de plata de muestras de LPS de las diversas cepas de E. coli. (B) Inmunotransferencia de las muestras de LPS realizada con antisuero específico contra el antígeno O12 de K. pneumoniae. Las muestras de LPS se obtuvieron según el método de Darveau y Hancock, 1983. El antisuero se obtuvo tal y como está descrito en Material y Métodos, 2.7.1. Carriles: 1, K. pneumoniae KT776; 2, E. coli DH5α; 3, DH5α con CosKT12; 4, cepa curada del carril 3; 5, DH5α con pJTO12; 6, E. coli CLM4 (∆wb); 7, CLM4 con pJTO12.

ribosomas a la distancia apropiada de los codones de inicio de cada ORF. El hecho de que las ORFs se solaparan y de que no se hallaran entre ellas secuencias similares a terminadores Rho-independientes, daba a entender que estas pautas abiertas de lectura formaban parte de una única unidad transcripcional. La secuencia de nucleótidos obtenida fue depositada en GenBank con el número de acceso AY130997.

Locus Posición % G+C codificada Proteina (kDa) pIa _GRAVYb rmlB (ORF1) 1-1065 57,8 39,4 6,1 -0,287 rmlA (ORF2) 1083-1988 55,6 33,1 5,3 -0,106 rmlD (ORF3) 1985-2875 61,3 31,7 5,8 -0,065 rmlC (ORF4) 2890-3444 54,4 20,2 5,7 -0,217 wbbL (ORF5) 3536-4366 34,5 32,1 8,7 -0,187 wzm (ORF6) 4396-5229 37,5 31,2 9,7 +0,978 wzt (ORF7) 5219-6541 43,8 48,2 6,1 -0,084 wbbB (ORF8) 6545-9346 39,9 106,8 5,8 -0,203

4.4 Análisis de las secuencias de aminoácidos deducidas de las ORFs

Los productos deducidos de las distintas ORFs fueron comparados con diversas bases de datos de proteínas para localizar aquellas con las cuales mostraran homologías (tabla 4.2). Se observó que los productos de las ORFs 1, 2, 3 y 4 eran muy similares a las enzimas características involucradas en la síntesis de la ramnosa en diferentes enterobacterias. Estas proteínas presentaban función dTDP-glucosa-4,6-deshidratasa, glucosa-1P-timidiltransferasa, dTDP-4-dehidroramnosa-reductasa, y dTDP-4-dehidro- ramnosa-3,5-epimerasa, respectivamente. Así pues, las ORFs1, 2, 3 y 4 corresponderían a los genes rmlB, rmlA, rmlD y rmlC.

La proteína de 276 aminoácidos codificada por la ORF5 presentó homología con la proteína WbbL presente en la agrupación génica wbO4 de S. marcescens, que tiene una presunta función ramnosil transferasa, por lo que dicho gen fue denominado wbbL.

ORF6 y ORF7 eran similares a proteínas que formaban sistemas de transporte tipo ABC-2 (ATP Binding Cassette-2). El producto de ORF6 presentaba un 84% de similitud con la proteína integral de membrana Wzm de wbSmO4, que forma parte del transportador ABC implicado en el transporte del antígeno O4 hacia el periplasma. Los análisis de hidrofobicidad realizados sobre la proteína codificada por ORF6 y la presencia de seis dominios transmembrana (en las regiones correspondientes a los aminoácidos 53-69, 84-100, 133-149, 158-174, 194-210 y 245-261) sugerían que ésta

Tabla 4.1. Agrupación génica wb de K. pneumoniae KT776 O12

a _{Punto isoeléctrico de la proteína calculado mediante ProtParam del servidor Expassy.} b _{Hidrofobicidad de la proteína, según el método de Kyte y Doolittle, 1982.}

se hallaba localizada en la membrana citoplasmática. Por su parte, el producto de ORF7 presentaba un nivel de similitud del 83% con la proteína Wzt de wbSmO4, responsable de la unión del ATP en el sistema de transporte tipo ABC que exporta el antígeno O4. Además, la proteína codificada por ORF7 contenía la secuencia de aminoácidos GRNGAGKS (en los residuos del 70 al 77) que correspondía a la caja A (Walker A Box), presente en las proteínas que unen ATP, y contenía también un motivo hallado comúnmente en proteínas de la familia transportador-ABC entre los aminoácidos 158 y 172 (YSSGMYVRLAFAVQA). Todos estos datos nos llevaron a denominar a ORF6 y ORF7 como wzm y wzt, respectivamente.

Proteína amino-Nº de ácidos % Simi- lituda % Iden- tidada Número de acceso en Genbank ORF1 (RmlB) K. pneumoniae KT776 RmlB 354 AY130997 Yersinia pestis RffG (RmlB) 355 81 72 NP407310 E. coli O157:H7 RmlB 355 79 70 NP312748 ORF2 (RmlA)

K. pneumoniae KT776 RmlA 301 AY130997

Y. enterocolitica RmlA 289 86 76 P55257

Y. pestis RffH (RmlA) 293 86 76 NP407309 ORF3 (RmlD)

K. pneumoniae KT776 RmlD 296 AY130997

Salmonella enterica RmlD 299 58 47 AAG09514

S. enterica sv. typhimuriumRfbD (RmlD) 299 58 47 NP461041 ORF4 (RmlC)

K. pneumoniae KT776 RmlC 184 AY130997

Shigella boydii RmlC 189 89 72 AAL27313

S. flexneri RfbC (RmlC) 181 78 68 P37780 ORF5 (WbbL) K. pneumoniae KT776 WbbL 276 AY130997 Serratia marcescens O4 WbbL 282 69 55 T31088 ORF6 (Wzm) K. pneumoniae KT776 Wzm 277 AY130997 S. marcescens O4 Wzm 277 84 75 T31089 ORF7 (Wzt) K. pneumoniae KT776 Wzt 440 AY130997 S. marcescens O4 Wzt 441 83 71 T31090 ORF8 (WbbB)b K. pneumoniae KT776 WbbB 933 AY130997 S. marcescens O4 WbbA 1191 58 39 T31091

Tabla 4.2. Porcentajes de similitud e identidad de las secuencias aminoacídicas de las proteínas codificadas en las pautas de lectura ORF1 a ORF8 de la agrupación génica wb de K. pneumoniae KT776 comparadas con otras proteínas significativas.

a _{Los porcentajes fueron obtenidos mediante comparaciones utilizando el programa Blast, en el servidor del} NCBI (National Center for Biotechnology Information).

Por último, la proteína codificada por ORF8 sólo presentó homología con la primera mitad (460 aminoácidos) de la proteína WbbA del conjunto de genes wb de S. marcescens O4 (Saigí et al., 1999). Al igual que WbbA, el producto de ORF8 mostró una posible función glicosil transferasa en la primera parte de la proteína y podría estar anclada a la membrana, ya que posee un presunto dominio transmembrana entre los residuos 334 y 350. Estos datos sugieren la existencia de algunas características similares en la primera parte de ambas proteínas, pero no en la última mitad. Dado que se ha sugerido que la proteína WbbA sea bifuncional, esto querría decir que una función está relacionada con una función de la proteína ORF8. La hipotética segunda función, sin embargo, sería diferente en ambas proteínas. Por la semejanza de ORF8 con algunos aspectos de WbbA, dicho gen fue denominado wbbB.