Técnicas de biología molecular

Las muestras de sangre de cordón, previamente descongeladas, se sometieron en primer lugar a un proceso de extracción del ADN bacteriano, en segundo lugar, a una amplificación y detección del microorganismo de la reacción en cadena de la polimerasa o pcr a tiempo real mediante el LigthCycler® SeptiFast Test (Roche Diagnostics®) y, por último, se procedió a la identificación automática de cepas y controles.

- Extracción de Ácidos nucleicos para SeptiFast Test en MagNA Pure COMPACT (Roche Diagnostics®):

Para ello, se han utilizado los equipos:

o MagNa Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit. o SeptiFast Lys Kit MGRADE.

o MPLC Total NA Isol. Kit-Lysis/Binding Buffer Refill.

La extracción mediante el LightCycler SeptiFast test MGRADE está basada en la lisis mecánica de 1 mL de sangre total mediante el kit de lisis SeptiFast Lysis y el instrumento Magna Lyser (Roche Diagnostics®).

En primer lugar, se realiza una lisis mecánica en dicho instrumento, previa a una incubación de las muestras lisadas a una proteasa y un tampón de lisis caotrópico que liberan ácido nucleico y protegen el ADN liberado de las Dnasas presentes en la sangre de cordón.

A continuación se introduce en cada muestra un volumen definido de control interno (CI) más el reactivo de lisis. El CI consta de moléculas sintéticas de ADN de doble cadena con sitios de unión de primers idénticos a los de las secuencias objetivo. El CI tiene contiene regiones de unión de sondas únicas que permiten diferenciar el CI amplificado del amplicón específico para el objetivo.

Después de añadir el tampón de unión, se transfiere la mezcla a una columna de centrifugación mediante un filtro de fibra de vidrio. El ADN objetivo bacteriano/fúngico se hibrida con la superficie de la fibra de vidrio. Las sustancias no unidas, tales como sales, proteínas y otros fragmentos celulares, se eliminan mediante un lavado en dos fases. Una vez completado el lavado, se eluyen los ácidos nucleicos absorbidos y una temperatura elevada.

El material eluído se someterá en el próximo paso al análisis de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (pcr).

- Amplificación y detección de la pcr a tiempo real mediante el LightCycler® Septifast Test:

1. Selección del objetivo: Se selecciona la región ITS (espaciador transcrito interno) como región objetivo para la diferenciación de las cepas bacterianas y fúngicas. Esta zona ofrece una mayor sensibilidad analítica que los genes de copia única porque existen varios operones en los genomas de bacterias y fungi. Además, la región ITS contiene más cepas específicas que el ARN ribosómico, por lo que resulta más adecuado para la diferenciación de las cepas. Se halla situada entre las secuencias de ADN ribosómico 16S y 23S de todas las bacterias Gram positivo y Gram negativo, y entre las secuencias de ADN ribosómico 18S y 5,8S de todos los fungi.

III. Sujetos y método

67 2. Amplificación: Antes de realizar la amplificación pcr debe reducirse el riesgo de contaminación del amplicón mediante el uso de la enzima AmpErase (uracil-N-glicosilada). Esta enzima reconoce y cataliza la destrucción de las cadenas de ADN que contienen desoxiuridina, pero no del ADN que contiene desoxitimidina.

Las muestras procesadas se añaden a la mezcla para amplificación que contiene polimerasa Taq de inicio en caliente en los capilares del LightCycler (100 µL) MGRADE _{en los que tendrá lugar la amplificación mediante pcr. Cada}

objetivo de la cepa especificada se amplifica mediante primers genéricos o específicos. Simultáneamente se amplifica una mezcla de objetivos en los controles de reactivos (RC).

3. Detección en tiempo real de productos pcr mediante sondas HybProbe: El amplicón se detecta mediante fluorescencia utilizando un par específico de sondas HybProbe. Dichas sondas marcadas mediante fluorescencia se hibridan en una secuencia interna del fragmento amplificado durante la fase de annealing del ciclo de amplificación. El equipo LightCycler® 2.0 se encarga de medir la emisión de fluorescencia en uno de los cuatro canales de detección existentes.

Una vez finalizada la amplificación se genera un análisis de la curva de fusión. La temperatura de fusión (o Temperatura melting: Tm) depende de la longitud, la secuencia y el grado de homología entre la sonda y el ADN objetivo. Las sondas están diseñadas para diferenciar las cepas por su Tm propia detectada en cada canal.

4. Identificación automática de cepas y controles: Las temperaturas de fusión (Tm) de las muestras y los controles se analizan mediante un software de identificación especial (software de identificación SetpiFast Identification Software), y se genera un informe.

Si se obtiene un resultado positivo de Staphylococcus aureus, cabe considerar la posibilidad de realizar una prueba de resistencia mecA posteriormente.

- Identificación automática de cepas y controles:

Las temperaturas de fusión (Tm) de las muestras y los controles se analizaron mediante un software de identificación especial (software de identificación SeptiFast Identification Software), generándose un informe final.

Las concentraciones bajas de Staphylococo coagulasa negativo (SCN) y Streptococci, que reflejan el rango de contaminaciones del flujo de trabajo no se muestran como resultados.

En la siguiente figura (Figura 6) se muestran las especies de microorganismos que detecta el Septifast, en función de los canales de longitud de onda a los que se pueden detectar y sus temperaturas de fusión.

III. Sujetos y método

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Figura 6. Distribución de los canales de detección de los microorganismos del Septifast, en función de la longitud de onda y sus temperaturas de fusión o Tm.