TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE CIANOBACTERIAS

El epiliton, constituido por las comunidades bióticas localizadas en la superficie de las piedras, se recogió tomando 3 piedras del lecho del río en cada punto de muestreo. Para la extracción del epiliton de las piedras recogidas, se seleccionó un área de 16 cm2 de la superficie rocosa que se raspó suavemente con ayuda de un cepillo de cerdas no muy duras (para que el roce no resulte excesivamente agresivo). El epiliton extraído se resuspendió en 10 ml de medio líquido BG110 (libre de nitrógeno). Todo el material utilizado en este punto debe ser previamente lavado con etanol, para eliminar contaminaciones sobre la muestra, y aclarado después con abundante agua destilada.

Este extracto de epiliton se utilizó para los distintos análisis biológicos y la siembra en placas Petri con distintos medios de cultivo. La siembra se llevó acabo inoculando 0.3 ml del extracto en las placas Petri con distintos medios de cultivo. Las placas se colocaron en un cultivador de placas (luz, 20-50 µmoles de fotones· m-2s-1, y temperatura, 25-28ºC). El cultivador está provisto de una serie de bandejas de

-44-

metacrilato en donde las placas son colocadas y unos fluorescentes laterales que proporcionan aproximadamente la misma intensidad de luz a todas ellas. Los ventiladores laterales actúan reciclando el aire de la cámara, manteniendo mejor la temperatura.

IV.2.2. Aislamiento de cepas a partir de colonias de cianobacterias

Una vez que las placas han sido sembradas, se mantuvieron en el cultivador durante 3 o 4 semanas hasta conseguir un crecimiento adecuado de las cianobacterias. Se realizó un seguimiento de las placas para que las colonias no llegasen a solaparse demasiado. El tiempo de cultivo fue variable en función de la piedra y del medio de cultivo empleado.

Pasado ese tiempo, se procedió al aislamiento de las cepas siguiendo el método descrito por Rippka (1988b), extrayéndose muestras de las colonias con un capilar muy fino fabricado a partir de una pipeta Pasteur. Con ayuda de una lupa binocular, se recogió (a poder ser) un único filamento de la colonia, que se sembró en una placa de agar al 1.5% y en el mismo medio del que procedía. Se mantuvieron en el cultivador hasta su crecimiento y se repitió el procedimiento hasta conseguir colonias monoclonales de las estirpes.

Una vez conseguido el aislamiento, se procedió a resembrar las cianobacterias en matraces Erlenmeyer de 50 ml que contenían medio de cultivo líquido. Cuando dicha especie comenzó a crecer, se puso en agitación para conseguir así mayor volumen de cultivo, necesario para los experimentos de caracterización genética y fisiológica. Todo el material utilizado para este proceso fue previamente lavado con HCl y esterilizado para evitar posibles contaminaciones que entorpecieran el proceso de aislamiento.

IV.3. TÉCNICAS UTILIZADAS PARA LA CARACTERIZACIÓN

MORFOLÓGICA DE CIANOBACTERIAS IV.3.1. Microscopía óptica

El análisis morfológico se llevó a cabo mediante observación macroscópica y microscópica de las muestras. Para el análisis macroscópico de las colonias crecidas en placas se empleó una lupa binocular con fuente de luz fría serie SZ 45 (Leica, Leica Microsystems, Wetzler, Alemania). El análisis microscópico se llevó a cabo utilizando un microscopio óptico Olympus BH2-RFCA (Olympus, Tokio, Japón) equipado con contraste de fases, epifluorescencia y un sistema de cámara de video (Leica DC Camera,

-45-

Leica Microsystems, Wetzler, Alemania) y en un microscopio Olympus BX61 (Olympus, Hamburg, Germany) equipado con una cámara DP70 CCD.

Se emplearon las siguientes características tradicionales para identificar a las cianobacterias estudiadas: morfología de la colonia, longitud y anchura de las células vegetativas, ausencia o presencia de vaina, longitud y disposición de los tricomas en las colonias, heterocistos y acinetos y forma del filamento.

Todas las cianobacterias empleadas en este estudio se clasificaron utilizando las claves dicotómicas de Geitler (1930-1932) y Desikachary (1959) principalmente, actualizando dichas determinaciones taxonómicas con las revisiones que han realizado Anagnostidis y Komarek (1988, 1990), Komarek y Anagnostidis (1989, 1999, 2005), Hoffmann (1988b) y Whitton (2002).

IV.3.2. Microscopía electrónica de transmisión (MET)

Para el estudio de la ultraestructura celular de algunas muestras, tanto de campo como de cianobacterias aisladas, se llevó a cabo mediante microscopía electrónica de transmisión. Las muestras fueron tratadas según el protocolo de Ascaso y Rapsch (1985). Para fijar las muestras se utilizaron una serie de soluciones: tampón Sorensen (NaHPO4/NaH2PO4 O.1M, pH 7.2), solución de Fijación (tampón Sorensen con glutaraldehido al 3.1 %), solución de Postfijación (tampón Sorensen con OsO4 al 1%) y solución de Agar (tampón Sorensen con agar purificado al 2%). Se recogieron 30 ml de cultivo y se lavaron con 10 ml de tampón Sorensen tres veces sucesivas, se centrifugaron 10 min a 10000 rpm en cada ocasión. Para hacer más fácil el manejo de las muestras se realiza una inclusión en agar. Así, tras el último lavado se resuspendió el sedimento con una gota de tampón Sorensen y una gota de agar a 40-50ºC en un tubo Eppendorf y se fragmentaron en cubos de aproximadamente 1mm de tamaño de arista.

A continuación se llevaron las muestras al Servicio Interdepartamental de Investigación (SIdI) de la Universidad Autónoma de Madrid para el tratamiento final que consistió en procesos de fijación, postfijación, deshidratación e inclusión en resinas, y finalmente, la realización de los cortes. Los cortes fueron de tipo ultrafinos contrastados con metales pesados (uranilo y plomo). Las muestras fueron observadas con el microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM1010 y fotografiadas con la cámara BioScan de Gatan y sistema de análisis de imagen (DigitalMicrograph 3.1).

-46-

IV.4. TÉCNICAS EMPLEADAS EN LA CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA: