CAPITULO I: FUNDAMENTO TEÓRICO
1.1. EL SAÚCO
1.1.10. TÉCNICAS DE RECOLECCIÓN, SECADO Y
Asimidor Publicaciones (1992), recomienda tener los siguientes criterios para colectar una planta o parte de ella: los tallos y las raíces se cortan antes de la floración. Las flores y las hojas durante la floración de la planta, esto es corroborado por Cemat y Farmaya (1990), y añade que las semillas deben recolectarse cuando estén secas.
Asimidor Publicaciones (1992), señala que todas las plantas se deben secar a la sombra. Si la rama es muy grande se corta en pedazos, si las raíces o tallos son muy gruesos se repartirán y cortarán en pedacitos, evitando siempre la exposición a los rayos solares; porque se ha comprobado que éstos sustraen los principios activos que nos interesan.
Después del secado, se procederá a guardarlas en envases de cierre perfecto, ya sea de metal, cristal, cartón, madera o cerámica. De no tener el material mencionado, debe buscarse el rincón más seco y con poca ventilación (Asimidor Publicaciones, 1992).
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En Guatemala las flores y hojas del saúco (Sambucus mexicana Pres1.), se recolectan durante la floración que es en los meses de abril a junio. (Cemat y Farmaya, 1990).
Font (1982) manifiesta por su parte que la segunda corteza, del saúco (Sambucus nigra), se desprende desde la primavera hasta el otoño. Las hojas se recolectan desde mayo y durante todo el verano, y las flores durante la floración o mejor un poco antes, y en junio en las montañas y tierras del norte, en Europa. Es importante secarlas rápidamente y con una buena ventilación al abrigo del sol y la lluvia, ya que sino se ennegrecen con facilidad. Los frutos se recogen avanzado el otoño, cuando están bien maduros.
1.1.11. METABOLITOS SECUNDARIOS
1.1.11.1. CONCEPTO Y LOCALIZACIÓN
Un gran porcentaje de los principios activos de plantas está comprendido dentro de los llamados Productos Naturales o Metabolitos Secundarios, que son compuestos químicos de estructura relativamente compleja, y de distribución más restringida y más característica de fuentes botánicas específicas que los llamados Metabolitos Primarios. Éstos están universalmente distribuidos y participan en la actividad celular de todo ser viviente. De lo primero, Productos Naturales o Metabolitos Secundarios, podemos decir que no son indispensables en las plantas que concurren; no intervienen o quizás, no se ha descubierto aún la función metabólica en la cual ellos intervienen; son considerados artículos de lujo en la planta (Lock, 1994)
Algunos autores han descrito a los Metabolitos Secundarios como Compuestos del Químico y a los Primarios como Compuestos del Bioquímico.
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Los principios activos no se distribuyen de una forma uniforme por toda la planta. Se concentran preferentemente en las flores, hojas y raíces; con menos frecuencia en las semillas, los frutos y la corteza (Lock, 1994).
Lock (1994), también manifiesta que es de gran importancia aislar los principios activos de las plantas y su localización en las diferentes partes de la planta o en los diferentes extractos debe ser motivo de ensayos biológicos adecuados.
Ante uno de los principales problemas que afrontan las industrias cosméticas y alimentaria, sea: como mantener la calidad y la vida de anaquel de sus productos, ante la creciente oposición (tanto de las autoridades reguladoras como de los consumidores) al uso de antioxidantes sintéticos y conservadores y estabilizantes químicos; la solución está en la activación de los poderes de conservación natural de ciertas hierbas, que logran los mismos efectos que los ingredientes sintéticos y químicos.
Una empresa israelí, ha logrado aislar y envasar ciertos componentes naturales del orégano, el romero y la salvia, que poseen atributos antioxidantes, formando una línea de productos denominados “herbáceos”, al servicio de las industrias alimentaria y cosmética (Expreso, 1995).
Los industriales dedicados a esta nueva línea de productos “herbáceos”, reconocen que existen muchas plantas poco conocidas que poseen idénticos y hasta mejores atributos que aquellas especies que actualmente vienen explotando; sin embargo, se han concentrado en las especies reconocidas por las autoridades de alimentos y sanidad como GRAS (en inglés, “generalmente considerado como seguro”), teniendo en cuenta que el limitar la investigación a estas plantas ya conocidas, eliminan la necesidad, que serían necesarios para explotar especies poco conocidas (Expreso, 1995).
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Las hierbas en estado natural no pueden ser usadas con fines conservadoras, ya que sería necesario grandes cantidades para conseguir el efecto deseado, dando lugar a que el aroma y sabor propio de cada especie vegetal se refuerce en el producto. En este sentido, los “herbáceos” son productos en los que se ha aislado y concentrado sólo aquellos ingredientes activos de la planta que interesan por sus efectos antioxidantes y conservadores. El resultado es una mezcla totalmente natural que permite retardar la oxidación, preservar las vitaminas, impedir el crecimiento de bacterias y hongos, evitar la degradación y la rancidez, estabilizar el color y mantener el sabor de los productos alimentarios y cosméticos. Adicionalmente, como se necesitan pequeñas cantidades, no existe limitación legal en los niveles de dosificación, habiéndose demostrado, inclusive, que en dosis iguales, los “herbáceos” son tres veces más efectivos que los conservadores sintéticos que los reemplazan (Expreso, 1995). Los “herbáceos” pueden ser utilizados en una gama de productos, desde goma de mascar hasta aceite bronceador, porque se hallan el forma de polvo o de líquidos de escaso aroma y mantienen la estabilidad a temperatura de hasta 200°C, son totalmente seguras y están clasificadas como suplemento alimenticio, no requieren licencias especiales y no implican restricciones de dosificación, siendo menos costosos que los ingredientes sintéticos y químicos (Expreso, 1995).
La actividad de los metabolitos secundarios es muy diversa siendo posible su aprovechamiento en diferentes formas, tanto casera como industrialmente.
Las quinonas son conocidas por sus propiedades tintóreas sin embargo algunas presentan otras propiedades, como la emodina que es catártica; la shikonina, antimocótica; el rhein,
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antirreumática, lapachol, citostática, bacteriostática, entre otros (Lock, 1994).
Se reporta que algunos alcaloides intervienen como reguladores del crecimiento, o como repelentes o atractores de insectos y también muestran diversas acciones, por ejemplo: jatrofano y maitansina representan acción antitumoral; codonopsina, cocculina y hoveína, hipotensivas, la criogenina, antiinflamatoria; la mitragina, analgésica; carpaina, antibacterial (Lock, 1994). Las cumarinas aisladas de plantas han despertado un gran interés por el amplio rango de actividad biológica que muchas han mostrado, como pro ejemplo la acción anticoagulantes y antibacterial del dicumarol, la acción antibiótica e la novobiocina, la acción estrogénica del cumestrol, la acción insecticida de los suragin A y B; cabe destacar también las aplicaciones de las cumarinas como saborizantes y en perfumes (Lock, 1994).
Los flavonoides se emplearon durante mucho tiempo como colorantes de lana, y actualmente se usan en la conservación de grasas o jugos de frutas, debido a las propiedades antioxidantes de algunas polihidroxiflavona. Entre otras aplicaciones, mencionaremos la de los glucósidos de hidrochalconas como edulcorantes y de la retenona como insecticida (Lock, 1994). La acción farmacológica de los flavonoides es también extensa y variada, son bien conocidas sus actividades contra la fragilidad capilar, dilatadores de las coronarias, espasmolítica, colerética, estrógeno y diurética. Así mismo, se destaca la actividad antimicrobiana de flabonoides prenilados y otros fenoles y la acción fungitóxica de algunas isoflavonas (Lock, 1994).
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1.1.11.2. DETERMINACION DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS
En pruebas preliminares, los métodos para la localización cualitativa o cuantitativa de uno o varios metabolitos secundarios o principios activos pueden ser (Domínguez, 1978).
a. Histológicos, o sea, observación del comportamiento de cortes de tejidos frente a ciertos reactivos que formen colores, den precipitados, etc.
b. Químicos, tratamiento de extractos con agentes cromógenos, sustancias que forman precipitados, etc.
c. Fisicoquímicos, uso de cromatografía, localización de ciertas bandas de absorción en el infrarrojo.
d. Biológico, ve el efecto del extracto sobre cultivos de microorganismos, grupos de ratones, embriones, órganos aislados, tejidos, etc.
En la práctica es ventajoso utilizar varios de estos métodos, procurando que no falte el biológico (Domínguez, 1978).
Se ha desarrollado una serie de métodos para la detección preliminar de los diferentes constituyentes químicos en las plantas, basados en la extracción de estos con solventes apropiados y en la aplicación de pruebas de coloración (Lock, 1994).
Existen pruebas que permiten detectar cualitativamente la presencia de determinados grupos de compuestos mediante las técnicas de “screening” (tamizaje), que se ayudan de la microquímica para evidenciar estos grupos de constituyentes mediante formación de precipitados coloraciones (Miranda, 1996).
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Estas reacciones se caracterizan por que son selectivas para las clases o grupos de compuestos que investigan y detectan la mínima cantidad posible (Miranda, 1996).
No debe olvidarse que cuando se obtiene un resultado negativo, éste puede deberse a la ausencia de la clase de compuestos buscada, a la selección errónea de solvente para extraer, a la presencia de sustancias extrañas que interfieren a una concentración en el orden de trazas del compuesto ensayado (Miranda, 1996).
Con relación a la selección del disolvente, éste da lugar a diferentes métodos o esquemas de trabajo para el tamizaje fitoquímico (Miranda, 1996).
Con relación a la selección del disolvente, éste da lugar a diferentes métodos o esquemas de trabajo para el tamizaje fitoquímico (Miranda, 1996).
Los extractos alcohólicos son útiles para averiguar la presencia de los principios activos más importantes (Domínguez, 1998).
Las pruebas sobre placas de cromatografía en capa delgada (CCD) son más convenientes para averiguar el número de componentes y por la intensidad de las manchas, su abundancia relativa. En algunos casos es posible hacer identificaciones relativas. Las mezclas empleadas son: a) Cloroformo-acetona (9:1) v/v; b) Bencenocloroformo (9:1) v/v; c) Cloroformo- tetrahidrofurano-ter-butanol-H2O (10:6:50:1) v/v; d) Acido- acético-n-butanol-H2O (7:2:1) v/v. Los agentes cromogénicos pueden ser (Domínguez, 1978): I) Tricloruro de antimonio al 1% en cloroformo (colores rojizo con esteroides, azules o violetas con triterpenos), II) Solución de Dragendorff modificada (los alcaloides dan manchas anaranjadas que no se desvanecen aún 24
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horas después), III) Vapores de yodo (es muy general, pero sencillo de utilizar), IV) Vapores de amoniaco (para flavonoides). En 1910 el ruso Mikhail Tsmott sentó las bases de las ventajas de la cromatografía, que permite analizar, localizar e identificar microgramos de sustancias y aislarlas hasta por miligramos (Sánchez, 1992).
Según plumier (1981), Izmailov y Shraiber describieron en 1938 la separación de extractos de plantas por cromatografía de capa fina en alúmina. Pero solamente 20 años después se comenzó a vender el equipo para la preparación de las placas.
La cromatografía es una técnica usada para identificar y cuantificar un número de sustancias de interés biológico, proviene del griego chroma: color, gras: escritura. Es un método fisicoquímico que permite separar los componentes o sustancias integrantes de una mezcla en movimiento por adsorción o separación diferencial de estos componentes sobre una superficie estacionaria o inmóvil (Sánchez, 1992).
El proceso cromatográfico implica una distribución diferencial de un soluto entre dos fases, una de las cuales está inmóvil o estacionaria (en el absorbente o papel) y otra móvil (disolvente o portadores). El sistema cromatográfico está formado por el disolvente, absorbente y los componentes de la mezcla, la interacción de los elementos de este sistema determina el grado de separación que se consigue en las condiciones de trabajo (Sánchez, 1992).
La separación de los compuestos en capa fina, según Plumier (1981), es semejante en muchos aspectos a la cromatografía en papel, pero tiene la ventaja adicional que se pueden usar medios diferentes de soportes y aún mezclas de los mismos. Al respecto, Sánchez (1992) manifiesta que este tipo de cromatografía es muy
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versátil, sensible y rápido para separar en forma bien definida compuestos estructuralmente muy parecidos.
Se pueden incluir también reactivos fluorescentes en el medio para ayudar a la identificación de manchas.
Para la mayoría de separaciones se considera apropiado que la capa tenga un espesor de 250 um. El material de capa fina depende de la mezcla que se estudie, de acuerdo a Sánchez (1992), los más usados son el gel de sílice, óxido de aluminio, celulosa, entre otros; pero se ha comprobado que el gel de silica es muy útil para la separación de una gran cantidad de compuesto (Plumier, 1981).
1.1.12. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
1.1.12.1. DETERMINACIÓN
La actividad antimicrobiana, según Jawetz y Col. (1974), se mide in vitro para determinar: (1) la potencia de un agente antibacteriano en solución, (2) su concentración en los líquidos del cuerpo o en los tejidos y (3) la sensibilidad de un organismo dado o concentraciones conocidas de la droga.
También manifiestan que la determinación de estas cantidades puede realizarse por uno de los dos siguientes métodos principales: dilución o difusión.
Las pruebas de dilución se llevan a cabo incorporando las sustancias antimicrobianas en cantidades medidas a medios bacteriológicos líquidos o sólidos, éstos se inoculan después con las bacterias de prueba y se incuban (Jawetz y Col, 1974).
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El punto final se toma como la cantidad de sustancia antimicrobiana requerida para inhibir el crecimiento, o para matar a las bacterias de prueba (Jawetz y Col., 1974).
En el método de difusión, se coloca en un disco de papel filtro, una copa porosa o un cilindro sin fondo (o una depresión en el medio sólido) conteniendo cantidades medidas de droga sobre un medio sólido que ha sido sembrado en forma abundante con el organismo de prueba.
Después de la incubación se toma el diámetro de la zona clara de inhibición que rodea el depósito de la droga, como medida del poder inhibitorio de ella contra el organismo de prueba particular (Jawetz y Col. 1974).
Farnsworth (1966) citado por Zapata (1987), reporta un estudio biológico y fotoquímico de numerosas plantas; además menciona que otros autores han estudiado la actividad antimicrobiana de plantas y hongos. Estudios similares se han llevado a cabo en Brasil, China, México, India, Japón, Filipinas, Rusia y otros países, tanto en plantas superiores como en algas y líquenes. Extractos de cultivos de raíz y semilla germinada o tejido de planta intacta, han sido examinados, mediante el método de disco de papel filtro. Estos presentaron actividad antimicrobiana contra Bacillus megatinum NRC 9076, Escherichia coli NRC 2014, Pseudomonas aeroginosa NRC 5055, Staphylococcus aureus NRC 15005 y Micrococcus sinegmatis NRC 43005. Ninguno de estos extractos era activo contra Candida albicans NRC 204009. Algunos extractos perdían su actividad parcial o completamente al ser expuestos a 121ºC por 20 minutos. Los más activos fueron los extractos de Lactuca sativa, Cannabis activa e Ipomea sp (Farnsworth, 1966).
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Lema y Col. (1994) reportaron un estudio en el que se determinó la actividad antimicrobiana de 17 plantas medicinales de Huarochirí y Huancayo, utilizando el método disco-placa-cultivo. Los diversos extractos obtenidos fueron ensayados frente a bacterias gram negativas y gram positivas y frente a una levadura (Candida albicans). De las 17 plantas estudiadas, 13 presentaron actividad antimicrobiana frente a por lo menos 4 bacterias gram positivas, una especie Solanum radicans mostró actividad frente a bacterias gran negativas y Jungalns netropica presentó actividad frente a la levadura.
Con los extractos que presentaron actividad antimicrobiana se realizaron pruebas cromatográficas a fin de determinar el grupo químico responsable de dicha actividad. Siendo un flavonoide en el caso de Achyrocline alatex y Psoralea pubescens el responsable de la actividad y en todos los demás casos la presencia de triterpenos y/o esteroides los responsables de dicha actividad (Lema y Col., 1994).
Zapata (1987), al realizar un estudio de la sangre de grado, obtuvo actividad antimicrobiana frente a los microorganismo gram positivos tales como St. Aureus ATCC 6538, St. Epidermis ATCC 1228 y Sacina lutea ATCC 2341 y los gram negativos Klebsella y Pseudomonas. El etanol fue el solvente adecuado para obtener el extracto seco utilizado en la evaluación. El método usado fue el de excavación-placa-cultivo.
Al respecto varios autores y entre ellos Mitacher y Col. (1972) citados por Rosales (1995), utilizaron al St. Aureus ATCC 13709, E. coli ATCC 9637, Salmonella gallinarum ATCC 9184, KLebsella pneumoniae A.D. ATCC 10031, Mycobacterium sinegmatis ATCC CO7 y Candida albicans ATCC 10231.
Ñaupari (1992) reporta que el extracto acuoso y metabólico del tocosh de papa y de su mazamorra presentan actividad frente a
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E.coli, St. Aureus y no presentan actividad frente a Y. enterocolítica ni Candida albicans. El método empleado fue el de disco-placa-cultivo.
Koneman y Col. (1990) señalan que las cepas de referencia para la prueba de susceptibilidad de difusión en discos son el St. Aureus ATCC 292122 y Ps. Fecales ATCC 29212, E. coli ATCC 25922 y Ps. aeruginosa ATCC 27583.
Rosales (1995) realizó ensayos de actividad antimicrobiana de los extractos acuoso y metabólico del tocosh crudo de maíz en bacterias (PCA), mohos (SDA) y levaduras. Reporta actividad frente a Micrococcus lateus, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Shigella dysentariae; no presentaron actividad frente al Staphylococcu epidermis, Saccharomyces cerevisiae ni Candida albicans.
Los extractos acuoso y metabólico del tocosh cocido presentaron actividad antimicrobiana frente al Micrococcus lateus, Stpahylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Shigella dysentariae, E. coli ATCC 8739, Klebsella pneumoniae, Salmonella sp. Y Pseudomonas sp. No presentaron actividad antimicrobiana frente a Candida albicans, Aspergillus oryzae, A. flavus y S. cerevisiae (Rosales, 1995).