Técnicas de PCR a tiempo real

La aparición de estas técnicas de detección directa, a inicios del siglo XXI, ha supuesto un gran avance en el diagnóstico molecular de la tuberculosis. Esta metodología se basa en la amplificación e hibridación simultánea del producto amplificado con sondas complementarias marcadas con fluorescencia (las más comunes: TaqMan, molecular beacons, bioprobes o FRET). Ello permite visualizar el resultado a tiempo real, a través de un gráfico donde se observa al grado de fluorescencia emitido, en función de la ausencia/presencia y cantidad de ADN de M. tuberculosis complex existente en la reacción. En muchos casos, el resultado que ofrecen estas técnicas es semi-cuantitativo, es decir, permite obtener una idea de la concentración inicial de ADN micobacteriano, en función del ciclo umbral de fluorescencia (ciclo en el que se detecta el incremento de la fluorescencia, respecto al nivel basal).

Una de estas técnicas comerciales, basada en la detección del 16S ARNr mediante detección con sondas TaqMan, es la técnica Cobas TaqMan MTB (Roche Diagnostics) [72],[73], derivada de la Cobas Amplicor MTB (PCR convencional) de la misma casa comercial. Aunque según algunos estudios, la versión a tiempo real no supone una mejora significativa en términos de sensibilidad, sí se aprecia un incremento de la especificidad y un descenso de resultados inválidos respecto a la versión convencional [74].

El FluoroType MTB (HainLifescience) es un sistema de muy reciente aparición (2011). Se trata de una PCR a tiempo real, aunque no integrada (la extracción de ADN puede ser automatizada pero en un aparato aparte) que detecta M. tuberculosis complex en 3 horas. Su diana es el IS6110, y las sondas de tiempo real son las denominadas Hybeacon. Las sondas Hybeacon se unen al producto amplificado y emiten fluorescencia, pero a medida que desciende la temperatura se separan, descendiendo también la fluorescencia. El software reconoce la curva de fluorescencia caracterísitca de M. tuberculosis complex. Las evaluaciones internas revelan una buena sensibilidad y especificidad pero aún no se dispone de estudios externos publicados que avalen su efectividad real.

El Anyplex plus MTB/NTM/DR-TB (Seegene Inc., Corea) es un sistema prometedor, de PCR a tiempo real con oligonucléotidos marcados, integrada, que sirve para la detección no sólo de M. tuberculosis complex, sino de otras micobacterias, en tan sólo 2 horas. Además, en caso de resultar un test positivo para M. tuberculosis, es posible determinar la resistencia a los principales fármacos antituberculsos (isoniazida y rifampicina) en un segundo test adicional que dura tan sólo 40 minutos. Sin embargo, aún no hay datos publicados acerca de su efectividad.

Recientemente, han aparecido nuevas técnicas que reducen a la mínima expresión la manipulación de la muestra y por tanto el riesgo de contaminación cruzada. El método más revolucionario en este sentido es el sistema GeneXpert (Cepheid, EEUU y FIND Diagnostics, Suiza), con el ensayo específico Xpert MTB/RIF para la detección de M. tuberculosis complex y resistencia a la rifampicina. Este sistema apareció en el año 2009, y los primeros estudios de evaluación fueron publicados a principios de 2010 [75]. La novedad que ofrece este sistema es que integra en un solo cartucho la extracción de ADN, la amplificación genética y la detección por hibridación con sondas a tiempo real (molecular beacons). La diana de amplificación que utiliza este sistema es la región core del gen rpoB que, como se detallará en el apartado 9.2, es la región determinante de la resistencia a rifampicina, con lo que el sistema Xpert MTB/RIF se presenta no sólo como un método de detección directa de M. tuberculosis complex, sino también de detección rápida de mutaciones relacionadas con la resistencia a la rifampicina. La detección a tiempo real se consigue gracias a la hibridación con 5 sondas complementarias a la región core del rpoB. La hibridación de al menos 3 de ellas significa detección de M. tuberculosis complex, y a su vez la hibridación de 3 ó 4 (todas menos 1 ó 2) evidencia al menos una sustitución nucleotídica en la secuencia wild-type del gen, con lo que se infiere la resistencia a la rifampicina. El software incluye una serie de algoritmos para ofrecer un resultado semicuantitativo del ensayo (MTB Detected High/ MTB Detected Medium/ MTB Detected Low/ MTB Detected Very Low/ MTB Not Detected). En caso de detectar ADN del bacilo, el informe del Xpert MTB/RIF ofrece un resultado de resistencia a la rifampicina (Rif Resistance Detected/ Rif Resistance Not Detected) (Figura 15). El ensayo contiene, además, unas esporas de Bacillus globii, las cuales son procesadas por el sistema, que extrae el ADN, lo amplifica e hibrida con unos primers y sonda específicos (control positivo). En caso de no lograrse la extracción y/o amplificación de este control, el resultado que da la

técnica no es válido (Invalid). El tiempo de respuesta del Xpert MTB/RIF es de 2 horas, con tan sólo 2 minutos de procesamiento manual.

Figura 15. Software del sistema GeneXpert (Xpert MTB/RIF) donde se observa el gráfico de

PCR a tiempo real, y el informe de resultados.

Varios estudios avalan la buena sensibilidad de este sistema, incluso en muestras con baciloscopia negativa, donde se alcanzan valores de sensibilidad de alrededor del 75% [75],[76]. La OMS, en el año 2011 y tras la revisión de los estudios publicados hasta la fecha acerca de la efectividad del Xpert MTB/RIF, publicó una serie de recomendaciones acerca del uso de este ensayo en los laboratorios de diagnóstico de tuberculosis. En un primer lugar, recomendó la realización de este test como primera herramienta de diagnóstico en países con alta indiencia de tuberculosis multirresistente (apartado 9) o coinfección con el VIH. En el resto de países, recomienda considerar este test como segundo sistema de diagnóstico (tras la microscopía), en casos de bacilocopia negativa. Estas recomendaciones sólo se aplicaron al diagnóstico de la tuberculosis pulmonar [77].

La técnica Xpert MTB/RIF sólo se validó en un inicio para muestras respiratorias, por lo que los estudios disponibles en la literatura están realizados predominantemente en este tipo de muestras. Recientemente, han comenzado a aparecer estudios en muestras extrapulmonares en adultos e incluso en niños [78]. Sin embargo, la mayoría de los trabajos publicados en muestras extrapulmonares incluyen un bajo número de muestras [79-81], o bien están realizados en zonas de alta incidencia tuberculosa [82]. Por último, y al ser el GeneXpert un sistema de elevado coste económico, se hacen necesarios estudios que evalúen su relación

coste-beneficio, para determinar la rentabilidad real que supone la realización de esta prueba.

Tabla 1. Tabla resumen de los métodos moleculares para la detección directa de M.

tuberculosis complex (tomado de Alcaide y Coll, 2011) [83].

Tab 1. Leyenda: IAC: Internal amplification control; PCR: Polymerase chain reaction; TMA:

Transcription-mediated amplification; LCR: Ligase chain reaction; SDA: Strand displacement amplification; NASBA: Nucleic acid sequence-based amplification; RT-PCR: Real-time PCR.