Concretamente nos centraremos en el problema de cómo se seleccionan las proteínas que, que sintetizadas en el RER han de ser transportadas hacia el Golgi, donde, tras ser modificadas, permanecerán en algún compartimento, si son residentes en el Golgi, o serán transportadas a lisosomas o a vesículas de secreción. O, lo que es lo mismo, como el sistema de transporte sabe que proteínas han de abandonar el RE y cuales han de permanecer en él. Estudiaremos básicamente 2 aspectos del transporte de proteínas del RER al Golgi:
Etapas del transporte y sus características
Se trata de un transporte bloqueable por temperaturas inferiores a 15º C. Se trata de un tráfico vesicular, mediatizado por vesículas revestidas, no por clatrina. Entre las dos posibilidades, de tráfico tubular y de tráfico vesicular entre el RE y el Golgi, las evidencias se pueden agrupar en do tipos:
- Evidencia morfológico: Presencia de un gran número de vesículas de transporte en la cara cis del complejo de Golgi.
- Evidencia genética: Novick et al. Desarrollaron una estrategia para el aislamiento de mutantes de la vía de secreción de proteínas de Saccharomyces cerevisiae sensibles a la temperatura. Después de mutagenización con etil – metasulfonato se crecen los cultivos a temperatura permisiva y después de aumentar notablemente la población se centrifugan en un gradiente de densidad. Las células que no pueden secretar las proteínas, las acumulan en el citoplasma, en vesículas membranosas, aumentando su densidad, por lo que son fácilmente diferenciables por gradiente de densidad.
Se han aislado de esta forma una serie de mutantes sensibles a la temperatura en levaduras deficientes en secreción, los mutantes sec. Novick et al identificaron 23 grupos de complementación. Actualmente se sabe que los mutantes que afectan al transporte entre el RER y el Golgi se pueden agrupar en dos grupos: aquellos implicados en la formación de vesículas y aquellos otros implicados en la fusión de dichas vesículas con la membranas diana. Asimismo se han identificado los genes BET, YPT1, SAR1 y ARF. Sec 18 es homólogo a NSF, requerido para el transporte intra – Golgi, y se requiere para la correcta fusión de las vesículas del ER al Golgi. Para funcionar NSF requiere la presencia de un receptor, proteína integral de la membrana y una pequeña proteína soluble SNAP, de la que al menos es homóloga sec 17. Los productos sec 12, 13, 16 y 23 forman un grupo de proteínas requeridas para la formación de vesículas de ER a Golgi. Existen 3 líneas de evidencia.
- No forman vesículas de transporte en condiciones restrictivas.
- Los mutantes no forman vesículas intermediarias de transporte in vitro.
- Parejas de mutantes no son letales, lo que parece indicar una acción cooperativa.
Cuando las células de levaduras mutantes para genes importantes en la fusión vesicular se exponen a temperatura restrictiva, aparecen abundantes vesículas entre el RE y el Golgi. Balch en 1990 indicó que a pesar de que el papel exacto de los componentes requeridos en la fusión vesicular es desconocido, parece que como si tanto el transporte entre el RE y el Golgi como el transporte entre las cisternas del Golgi requiriera componentes similares. Sería una misma maquinaria molecular la responsable de la formación de vesículas y de la fusión entre los diferentes compartimentos de la vía exocítica.
También conocemos que existirían 2 tipos de partículas recubiertas en la vía endocítica: aquellas derivadas de endosomas, recubiertas de clatrina, y aquellas otras de transporte anterógrado en la vía que estarían recubiertas de otros componentes moleculares, entre los que cabe destacar la proteína COP. Uno de los descubrimientos más importantes referidos al transporte entre RE y Golgi y a través del Golgi es el papel que juegan las proteínas “Ras related small GTP – binding proteins”, que son requeridas para la regulación de la vía exocítica a todos los niveles. En levaduras incluyen a las proteínas YPT1, ARF y SAR1, anteriormente citadas, todas ellas implicadas en el paso de RE a Golgi, y sec4, que está implicada
Se trata además de un tráfico sensible a ATP, calcio, GTP y N – etilmaleimida: - Se requiere ATP para que se produzca el transporte
- Se requiere Calcio en el paso de RE a Golgi, y parece relacionado con la etapa de fusión de vesículas y con el papel de YPT1.
- Requiere GTP. Análogos de GTP como GTP – gamma – S, no hidrolizable, bloquean el transporte, lo que está en relación con las small GTP binding proteins.
- N – etilmaleimida. Tratamientos con Ac. anti – NSF, N – etilmaleimida sensitive factor, son capaces de bloquear el paso de RE a Golgi El tratamiento con N – etilmaleimida también inhibe el transporte.
Existe una droga que bloquea el transporte anterógradao del RE al Golgi. Se desconoce el funcionamiento de la brefeldina A, droga sintetizada por algunos hongos, derivada de ácido graso. La brefeldina desorganiza el Golgi, induciendo la rápida redistribución del Golgi en el RE, desapareciendo las estructuras reconocibles como Golgi e impidiendo el transporte de proteínas a cualquier compartimento post – Golgi. Se propone que podría actuar o bien por el bloqueo del movimiento anterógrado o por activación del movimiento retrógrado. Su eficacia a concentraciones de 10-8 M sugieren que la unión al
receptor se produce con elevada afinidad. El efecto de la brefeldina es rápido, en 30 minutos, todo el marcador del cis – medio Golgi manosidasa II ha pasado a tener una distribución en el RE, así como otros marcadores trans como la galactosil transferasa. Para poder actuar, la brefeldina A depende de la disponibilidad de ATP. El efecto de la brefeldina A es dependiente también de Microtúbulos , ya que agentes disruptores de microtúbulos como el nocodazol destruyen la vía retrógrada, impidiendo la desorganización del Golgi. El mismo efecto producen los bloqueadores de la disponibilidad de energía como la azida sódica o la deoxi – d – glucosa. La desorganización es dependiente también de temperatura, de manera que a 16ºC, aún habiendo pasado 2 horas, la manosidasa dará señal en el Golgi.
El transporte anterógrado es independiente de microtúbulos. Se demostró que el movimiento anterógrado es independiente de MT, mediante el seguimiento de la señal de manosidasa II en células NRK tratadas con BfA durante 1h y dejadas en un medio libre de BfA con y sin nocodazol, inhibidor de la polimerización de tubulina. Se observó que el nocodazol no afectaba a la recuperación de la distribución normal del marcador de manosidasa II.
En resumen:
- Existe un transporte anterógrado en dos fases:
o Paso a un compartimento intermedio. No se ve afectado por el bloque a 15ºC o Desde el compartimento intermedio al cis Golgi, bloqueable por temperatura. - Existe un transporte retrógrado, posiblemente sea el mecanismo de recuperación de las
proteínas que siendo residentes en el RER escapan de él. Es dependiente de MT.
Mecanismos de transporte y retención
El mecanismo de transporte ha de ser capaz de discernir entre las proteínas residentes en el RER y aquellas que pasarán al Golgi. Existen evidencias que las proteínas residentes en el RER no suelen alcanzar el Golgi, sino que son retenidas en el RER. Esto se basa en que:
- Nunca se han detectado en el Golgi.
- Las proteínas residentes en el RER no presentan modificaciones posttraduccionales que se realicen en el Golgi, como la por ejemplo las etapas posteriores de la maduración de las cadenas de glucopolisacáridos.
Esto conduce a la idea de que el transporte entre RER y Golgi es unidireccional y selectivo, por lo tanto, ha de existir un mecanismo capaz de seleccionar las proteínas que siguen hacia el Golgi y cuales no.
Existen 2 posibilidades básicas:
- Transporte selectivo. Implicaría que cada proteína es reconocida a lo largo de la vía por un receptor que le permite el paso a la siguiente etapa. La ausencia de reconocimiento supondrá la retención.
- Transporte masivo. Por el contrario, todas las proteínas seguirían un flujo masivo, excepto aquellas que fueran reconocidas como propias en el compartimento en el que son residentes. Según este modelo, el contenido de cada compartimento pasa al siguiente por defecto. Algunos autores estiman que en el RER normal de una célula, sólo 1 de cada 1000 moléculas de proteína está destinada al transporte al Golgi, el resto son residentes en el RER. El proceso de selección de estas proteínas deber ser por lo tanto muy eficiente para poder mantener esta relación. Rothmann propuso la denomina hipótesis de “destilación”, según la cual, el cis golgi actuaría como destilador, seleccionado las proteínas residentes en el RER, y devolviéndolas, dejando pasar al trans Golgi sólo las proteínas seleccionadas. Diversos autores han cuantificado los tiempos de residencia de las proteínas sintetizadas en el RER y observan que diferentes proteínas de secreción salen del RER a diferente velocidad.
Existe una secuencia, que provoca que la proteína que la presente quede retenida en el RE. Esta secuencia es la secuencia KDEL. Los receptores de KDEL están situados tanto en RE como en Golgi. Los receptores de KDEL están expresados en levaduras mediante el gen erd1.