SISTEMA
MUESTRA
TIEMPO
6 hrs
12 hrs
24 hrs
1
Control
C
C
C
2
SI 10 µg/mL + Apirina 5mM.
10 SI
10 SI
10 SI
3
SI 100 µg/mL + Aspirina 5mM
100 SI
100 SI
100 SI
4
SI 200 µg/mL + Aspirina 5mM
200 SI
200 SI
200 SI
5
Aspirina 5mM
6 A
12 A
24 A
El control (sistema 1) contiene sólo cultivo primario de macrófagos peritoneales. Los macrófagos con EHSI a diferentes concentraciones, fueron incubados por 24 horas antes de ser tratados con Aspirina por 6, 12 y 24 horas adicionales (sistemas 2,3 y 4). Por último, se tiene la muestra de macrófagos incubados por 6, 12 y 24 horas sólo con una solución de Aspirina 5mM (sistema 5).
2.6. DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD
La viabilidad de las células macrófagas en el cultivo primario, sensibilizadas con lisado bacteriano de E. coli, fue determinada mediante la incubación del extracto hidroalcohólico de Sacha Inchi (EHSI) a diferentes concentraciones (10, 100 y 200 µg/mL) durante 24 horas y luego incubadas con una solución de Aspirina 5mM, durante 6, 12 y 24 horas. Estas muestras fueron comparadas con la muestra control y la muestra tratada solo con Aspirina.
Para cuantificar la viabilidad, se colorearon las células macrófagas con el cromóforo azoico azul de tripán. Las células viables no permiten que el colorante azoico atraviese la membrana citoplasmática intacta, al ser selectivas, mientras que en la membrana de las células muertas si las atraviesa, coloreándolas. Las células muertas se muestran con un distintivo color azul en el microscopio, empleando una cámara de Neubauer para el conteo y por diferenciación, permite determinar las células viables.
2.6.1.Procedimiento.
Se mezcló 15µL de cada cultivo celular, con 5µL de azul de tripano en un tubo de Eppendorff.
Se cargó la cámara de Neubauer con 10µl de cada muestra para realizar la citometría, empleando un Microscopio óptico, con un objetivo de (10 x 40).
Se tomaron fotografías por campo, realizando cinco réplicas por muestra. (Fotografías. ANEXO-2
2.7. DETERMINACIÓN DE ÓXIDO NÍTRICO
Se determinó la concentración de óxido nítrico en todos los sistemas de tratamiento, antes de iniciar el procedimiento de RT-PCR. La determinación se realizó por el método de Griess,129 cuantificando el contenido de nitritos en el sobrenadante del
cultivo primario de macrófagos peritoneales, de los 15 tratamientos. Se tomó 100 μl de sobrenadante los cuales se incubaron con 100 μl de una mezcla de sulfanilamida 1%, naftiletilendiamida 0,1% y ácido fosfórico 2,5% (reactivo de Griess), a temperatura ambiente por 10 minutos. Se midió la absorbancia de las muestras a 570 nm de longitud de onda. Factor de calibración = 163.8 M/uABS.
2.8. EXPRESION DE LOS CITOCROMOS P 450
Para evaluar el rendimiento de la expresión de genes específicos, se extrae el total de RNA y se realiza una síntesis de cDNA a través de la transcriptasa reversa, para luego amplificar los transcriptos por RT-PCR, e identificar la expresión de genes específicos en los distintos tratamientos.130
2.8.1. Procedimiento en la extracción del RNA mensajero
Para la extracción de RNA total se usó el Kit TRizol® Reagent de Invitrogen “SuperScript™ First Strand Syntesis For RT-PCR SS™ II RT”, de Invitrogen.
Se transfirió a tubos Falcon de 200ml, el contenido total de los diferentes medios de cultivo de las placas que recibieron los tratamientos con el extracto hidroalcóholico de Sacha Inchi, a diferentes concentraciones y con la solución de Aspirina.
Se centrifugaron los tubos Falcon a 1200rpm por 5min. Se decantaron los sobrenadantes obteniendo pellets. A los pellets por cada 70 mg, contenidos en los tubos Falcon, se les adicionó 1mL de RNAzol y se agitaron en un shaker por 5min.
Las suspensiones se transfirieron a tubos Eppendorff, allí se se les agregó 400µl de agua destilada-desionizada y se dejaron reposar por 15min; para luego centrifugar a 12000 rpm por 15min, dando como resultado la presencia de dos fases.
Se decantó el sobrenadante a otro tubo Eppendorff, en el que se precipitó el RNA con 700µl de isopropanol frío, durante 15min, centrifugándolos, posteriormente, a 12000rpm durante 10min.
Para el lavado de RNA, el precipitado fue mezclado lentamente con 400µl de etanol al 75% y luego fue centrifugado a 10000rpm por 10min, a temperaturas comprendidas entre 2 a 8°C, repitiéndose este procedimiento dos veces.
Se eliminó cuidadosamente el sobrenadante colocándolo en un sistema Thermoblock, por 5 min, a 60°C, para evaporación total del etanol.
Se disolvió el RNA total obtenido, con 50 µL de Agua-DEPC y se almacenó a -20°C, hasta su uso.
2.8.2. Control de calidad del RNA mediante electroforesis.
En esta etapa se comprobó la calidad del RNA extraído, mediante el siguiente esquema operacional:
1. Para la muestra de corrida, se tomó 5µL de la solución conteniendo RNA y 1µL de buffer de carga (formamida desionizada 0.5%, formaldehido 6%, glicerol 0.13%, azul de bromofenol 0.013% contenidos en la solución tampón de
MOPS/EDTA).
2. Se realizaron las corridas electroforéticas empleando como soporte el gel de agarosa al 1.5%, con 1µL de SYBR Green a 100 voltios, durante 10 min.
2.8.3. Síntesis de cDNA
Para la síntesis de cDNA, se utilizó el Kit de Thermo Scientific, que incluye una mezcla de cebadores inespecíficos: Oligonucleótidos polidT que hibrida con las secuencias poli A de los RNA mensajeros. El procedimiento efectuado se realizó de acuerdo a las especificaciones del producto:
1. Se colocó en un tubo de PCR la mezcla del primer RNA: 2µL de RNA, 1µL primer
oligo-dT y 9µL de agua libre de nucleasas, obteniendo un volumen total de 12µl.
2. Se llevó al termociclador durante 5 min a 65°C.
3. Se agregó el mix de síntesis de cDNA a cada muestra de RNA: 4µL de buffer de carga, 1µL de inhibidor de RNasa, 20µL de 10 mM dNTP mix, 1µL de transcriptasa reversa.
4. Se colocó en el termociclador por 60 min a 42°C y se inactivó la reacción por calentamiento a 70°C por 5 min.
2.8.4. Amplificación de los genes de Citocromo P450
El cDNA de cada muestra resultante de la etapa anterior, para cada tiempo de tratamiento de 6, 12 y 24 h, fue sometido a una reacción de PCR, con la finalidad de amplificar los genes CYP1A1 (P450 1A1), CYP2C24 (P450 2C24), CYP2E1 (P450 2E1), CYP3A2 (P450 3A2) y CYP4A1 (P450 4A1), usando como control de carga a la β-Actina.