TECNICA PARA EL AISLAMIENTO E INCUBACION DE ISLOTES DE LANGERHANS.

2.6.1. Aislamiento de islotes en ratas adultas.

Para el aislamiento de los islotes de Langerhans y su posterior incubación se ha seguido el método descrito por Malaisse-Lagae y Malaisse (1984); dicha técnica permite valorar la influencia de agentes ambientales sobre la actividad secretora de las células beta pancreáticas in vitro.

El aislamiento de los islotes se realiza a partir de páncreas de ratas machos de 70 días de vida, utilizando de 2-5 páncreas por experimento.

Una vez sacrificados los animales, se procede a la apertura de la cavidad abdominal para localizar el páncreas y el conducto biliar. El extremo de este

conducto, más cercano al duodeno, se cierra; en el otro extremo, próximo al hígado, se inserta aproximadamente un centímetro de un catéter de poliestireno de 0.96mm de diámetro y se asegura en la zona con una ligadura. Dicho catéter se encuentra encajado en una jeringa de lOmí y, a través de él, se introducen de 15 a 20m1 de una solución de Hanks [NaCí: l37mM; KCl: 5.36mM; NaiHCO3: 4. l7mM; CaCl2, 2 1120: 1.26mM; MgSO4, 7 H20: 0.8lmM; KH2PO4: O.44mM; Na2HPO4, 2 1120: 0.34mM]. Esta inyección de liquido llena los principales conductos pancreáticos que abren al conducto biliar provocando una destrucción mecánica de la glándula exocrina. Una vez que el páncreas está bien hinchado, se libera del estómago, del duodéno, del bazo y de sus conexiones vasculares; posteriormente, se procede a su limpieza eliminando la grasa y los ganglios que puedan existir. Una vez obtenidos los páncreas, se cortan de forma mecánica con unas tijeras de punta roma hasta conseguir trozos de aproximadamente 1-2mm. Este proceso va a facilitar la posterior digestión del tejido.

La digestión se realiza en presencia de Colagenasa (Colagenasa P de Clostridium Histoliticuni, actividad: 2U/mg; Boetiringer) a razón de 5 mg de Colagenasa por páncreas. La mezcla de páncreas y Colagenasa se incuba durante 10 minutos a 370C bajo corriente de carbógeno [95% 0, / 5% CO2], seguida de agitación manual. La digestión se interrumpe al realizar una dilución con medio Hanks. La preparación así obtenida se somete a una serie de lavados-sedimentaciones (de duración cada vez menor), cuyo objeto va a ser el de separar los islotes de la masa de tejido que sedimenta más lentamente. Finalmente, éstos son visualizados con una Lupa (Wild M38, Heerbrug) y pueden ser pescados de forma individual con la ayuda de una varilla de vidrio que presenta una curvatura en su extremo.

Tanto los lavados como la recuperación de los islotes se realiza en una

solución de Hanks.

2.6.2. Aislamiento y cultivo de islotes fetales.

Los islotes fetales se obtienen a partir de páncreas de fetos de 21 días de gestación y siguiendo la técnica descrita por Hellerstróm y cols. (1979). Con este método es posible aislar una gran cantidad de islotes fetales libres compuestos predominantemente por células beta.

Una vez sacrificada la madre, se extraen los fetos y se les separa de sus respectivas placentas. Se realiza la técnica con un número de fetos que oscila entre 12 y 24. Los páncreas obtenidos de los animales se depositan en un recipiente que contiene una solución de Hank esteril (Hank’s balanced salt solution, JCN) y se limpian de los restos de bazo e intestino que puedan tener. Una vez limpios se colocan en un vial que contiene 4m1 de Hank esteril y se añade la Colagenasa (Colagenasa P de Clostridium Histoliticum, actividad: 2U/mg; Boehringer Mannheim) a razón de 0.28mg por páncreas.

La digestión se realiza durante 10 minutos a 370C en bailo maría con agitación, seguida de agitación manual. El Hank estéril lleva adicionado Rojo de Fenol, indicador que sufre un pequeño cambio de color cuando la digestión ha finalizado. A partir de ese momento el proceso se realiza en cámara de flujo laminar (Telstar, 5 .A. Tessana, España). Una vez lavada la preparación con Hank estéril se le añade medio de cultivo (RPMI-1640, JCN al que se adiciona L-glutamina - Glutamine 200mM, ICN- y antibióticos -Penicillim and Streptomycin, ICN-) y suero de vaca fetal (Heat inactivated foetal bovine serum sterile, ICN) y se introduce en las placas de cultivo (tissue culure multiwell plate with cover, ICN). Se mantienen a 370C y con una atmósfera de 5% de CO2 (cámara Haereus) de 5 a 7 días. El

cambio de medio se realiza cada dos días, con lupa (Wild M38, Heerbrug), para evitar arrastrar los islotes, y en cámara de flujo laminar.

Después de un día de cultivo, la masa de células y los fragmentos de tejido se van depositando en el fondo de la placa y los islotes se pueden distinguir tanto aislados como rodeados de células acinares. Entre los días 2 y 4 las células exocrinas van desapareciendo gradualmente y proliferan un gran número de células similares a fibroblastos que forman una monocapa en el fondo de la placa de cultivo. Al final del periodo de cultivo, la parte acinar desaparece por completo y sólo se observan los islotes y la capa de células similares a fibroblastos.

Los islotes aislados con esta técnica parecen representar un rango de tallas con predominancia de islotes pequeños, lo cual es similar a la situación in vivo (Hellertróm, 1977). Después del periodo de cultivo los islotes están preparados para su incubación estática.

2.6.3. Incubación estática de los Islotes.

La incubación de los Islotes ha de realizarse inmediatamente después de que éstos sean pescados.

Grupos de 6 ó 7 islotes son colocados en pocillos (de 1cm de diámetro y 2- 3cm de alto) que contienen 1 ml de medio de incubación; estos pocillos, a su vez, son introducidos en viales de centelleo e incubados en un baño con agitación a 370C durante un periodo de 90 minutos. Durante los cinco primeros minutos de la incubación los viales son gasificados con gas carbógeno. El medio de incubación consiste en una solución tampón-bicarbonato [NaCí: 1 l5mM; NaHCO3: 24mM; KCl: 5mM; MgCl2, 6 H20: lmM; CaCl2, 2 H20: lmM;] (medio Krebs) que contiene albúmina bovina (5 mg/mí; Fracción V; SIGMA>. Al medio se adicionan los

distintos secretagogos a evaluar: 1) Glucosa 2.8mM 2) Glucosa 2.8mM + l9mM de Arginina 3) Glucosa 16.7mM 4) Glucosa 16.7mM + l9mM de Arginina 5) Leucina lOmM

Después de la incubación, el sobrenadante, que contiene la insulina liberada, es recuperado de los pocillos con una pipeta Pasteur. Este procedimiento ha de realizarse bajo la Lupa para evitar arrastrar algún Islote. El sobrenadante así obtenido es entonces conservado a ~20oC hasta el momento en el que se valore la cantidad de Insulina liberada por los Islotes.

2.6.4. Extracción de la Insulina de los Islotes.

Para valorar el contenido de insulina que existía en los Islotes, se recogieron grupos de 20 Islotes en 0.5 ml de una mezcla ácido-alcohol (‘75% de etanol, 1.5% de ácido clorhídrico 12N y 23.5% de agua destilada). Una vez recopilados, fueron homogeneizados y posteriormente sonicados (en un sonicador Ultrasonic Power Unit M.S.E. England), lo que produjo la ruptura de las células con la consecuente liberación de la insulina contenida en los islotes. El extracto que se obtuvo se conservé a -20<> C hasta su valoración.