Concentración Observada
Figura 3. Estabilidad de la amoxicilina (AMX) a un nivel de concentración de 0,5 µg/g en huevo tras ser sometido a proceso de cocinado mediante microondas durante diferentes tiempos. *Diferencias significativas con valor de P<0,05, **Diferencias muy significativas con valor de P<0,01 y ***Diferencias extremadamente significativas con valor de P<0,001
34
0
1
2
3
4
5
6
7
8
**
***
***
-74
-65
-45
90
60
30
Concentración (µg/g)
Tiempo de Cocción (seg)
Concentración Esperada
Concentración Observada
Figura 4. Estabilidad de la amoxicilina (AMX) a un nivel de concentración de 2,5 µg/g en huevo tras ser sometido a proceso de cocinado mediante microondas durante diferentes tiempos. *Diferencias significativas con valor de P<0,05, **Diferencias muy significativas con valor de P<0,01 y ***Diferencias extremadamente significativas con valor de P<0,001
35 1 2 3 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 *** *** *** -82 -76 -63 Concentración (µg/g)
Tiempo de Cocción (min) Concentración Esperada Concentración Observada
Figura 5. Estabilidad de la amoxicilina (AMX) a un nivel de concentración de 0,5 µg/g en huevo tras ser sometido a proceso de cocinado tipo “tortilla a la sartén” durante diferentes tiempos. *Diferencias significativas con valor de P<0,05, **Diferencias muy significativas con valor de P<0,01 y ***Diferencias extremadamente significativas con valor de P<0,001
36
1
2
3
0
1
2
3
4
5
***
***
***
-86
-82
-56
Concentración (µg/g)
Tiempo de Cocción (min)
Concentración Esperada
Concentración Observada
Figura 6. Estabilidad de la amoxicilina (AMX) a un nivel de concentración de 2,5 µg/g en huevo tras ser sometido a proceso de cocinado tipo “tortilla a la sartén” durante diferentes tiempos. *Diferencias significativas con valor de P<0,05, **Diferencias muy significativas con valor de P<0,01 y ***Diferencias extremadamente significativas con valor de P<0,001
37 4.5. Efecto de deshidratación en los procesos de cocinado
El efecto de deshidratación observado en los procesos de cocinado del huevo evidenciado por un aumento de la concentración de potenciales residuos de AMX, EFX, ABZ y FLBZ tras el cocinado en microondas o tipo tortilla se muestra en figura 7.
38 A
B
Figura 7. Efecto de deshidratación de las muestras de huevo observado durante el cocinado en microondas (A) o tipo tortilla (B). Se reporta el aumento de la
39 concentración de potenciales residuos de droga (AMX, EFX, ABZ y FLBZ) a los diferentes tiempos de cocinado.
40 5. DISCUSIÓN
El presente trabajo de tesis forma parte de una línea de investigación llevada a cabo en el Laboratorio de Farmacología (CIVETAN-UNCPBA) centrada en el estudio de fármacos de uso en producción avícola, abordando aspectos farmacocinéticos y de perfiles de residuos en los alimentos obtenidos en dicha producción. Uno de los trabajos llevados a cabo dio lugar a la Tesis Doctoral titulada “Evaluación de residuos medicamentosos en aves: Impacto en producción y en la calidad higiénico sanitaria de alimentos derivados” defendida en el año 2014. Entre los ensayos realizados en la misma, se evaluó la estabilidad de los residuos de ABZ y sus metabolitos en huevo sometidos a procesos de cocinado. A partir de los resultados obtenidos y los interrogantes generados, decidimos continuar y completar dicho trabajo, dando lugar al presente proyecto en el cual evaluamos la estabilidad de potenciales residuos de varias moléculas, incluyendo ABZ, en huevo sometido a distintos procesos de cocinado tradicionales como hervido, microondas y tortilla. Además de evaluar la estabilidad de los residuos de ABZ, también se evaluó la de FLBZ, otro antihelmíntico del grupo, además de dos antibióticos de gran uso en producción avícola como son la AMX y la EFX (Ramos et al, 2012; Lolo et al, 2006; Javadi et al, 2011).
Existen trabajos reportados en los cuales se evalúa la estabilidad de drogas veterinarias en distintos alimentos de origen animal (vaca, pollo, cerdo, pescado, entre otros) luego de someterlos a algún tipo de tratamiento térmico (Abou-raya et al, 2012; Cooper et al, 2011; Furusawa y Hanabusa, 2002; Grunwald y Petz, 2003; Imperiale et al., 2009; Jadavi et al, 2009, 2011; Khattab et al, 2010; Lolo et al, 2006; Mitrowska et al, 2007; Papapanagiotou et al, 2005; Pitt et al, 2011; Rose et al, 1997, 1998; Shakila et al., 2006; Tarbin et al, 2005). En cambio, la información disponible sobre la estabilidad de residuos de fármacos en huevo tras el procesado del mismo es relativamente escasa (Rose et al, 1997; Furusawa, 2002; Khattab et al 2010; Alaboudi et al, 2013; Bistoletti, 2014).
Dentro del grupo de los antihelmínticos BZD, el FLBZ es el único aprobado para uso en avicultura en la mayoría de los países, del cual se reporta un LMR para
41 huevo. Sin embargo, existen evidencias de que el ABZ, cuya eficacia antihelmíntica se ha demostrado en pollos/gallinas (Tucker et al, 2007), se ha usado de forma “extraetiqueta” en esta producción. A raíz de ello, cuando se estudió el comportamiento farmacocinético de dicha molécula en gallina ponedora, se cuantificaron concentraciones plasmáticas tanto de la droga madre como de sus metabolitos sulfóxido y sulfona (Bistoletti et al., 2013), así como residuos de las mismas en el huevo cuando se lleva a cabo una administración terapéutica en el alimento (Bistoletti, 2014).
En el presente trabajo, cuando evaluamos la estabilidad de los residuos de ABZ y sus metabolitos, ABZSO y ABZSO2 en el huevo hervido, se observó que para el ABZ en algunos tiempos había pérdida y en otros ganancia, sin una tendencia clara (Tabla 1). Para el caso de ABZSO se evidenció una disminución de la droga en la concentración baja y un aumento en la concentración alta (Tabla 2). Sin embargo, cuando llevamos a cabo la comparación estadística para ambas moléculas dichos cambios no fueron significativos. Por el contrario, el ABZSO2, durante el hervido presentó un aparente incremento significativo en la cantidad de la droga en ambas concentraciones a todos los tiempos (5, 30 y 45 min) (Tabla 3). Cuando el proceso de cocinado fue en microondas, lo primero que observamos fue un evidente proceso de deshidratación de la muestra de huevo, es por ello que se reportaron las concentraciones esperadas, resultantes de la corrección de la concentración por la pérdida de agua después del cocinado (Figura 7A). Los residuos de ABZ, disminuyeron en todos los casos, aunque dicho cambio no fue significativo desde el punto de vista estadístico, a excepción de la concentración alta, en el primer tiempo de cocinado (30 s) (Tabla 4). El ABZSO presentó la misma tendencia a la reducción en todos los casos, no obstante el estudio estadístico, tampoco mostró diferencias significativas (Tabla 5). En cambio, para el ABZSO2, se observó la misma tendencia mostrada durante el hervido, con un incremento en la cantidad de la droga con respecto a la adicionada (Tabla 6). Para el cocinado del huevo tipo tortilla, también la muestra perdió peso debido a la deshidratación durante el procesado, por lo cual se debió calcular la nueva
42 concentración, reportándose como concentración esperada (Figura 7B). Los residuos de ABZ disminuyeron en todos los casos (Tabla 7), sin embargo luego de realizar la comparación estadística, sólo mostró diferencias extremadamente significativas la concentración baja. Esto puede deberse a que en las mismas condiciones, la cantidad de droga que se pierde en ambas concentraciones es similar y por lo tanto la proporción es mayor para la concentración baja, dando lugar a las diferencias significativas. Para el ABZSO se observó la misma tendencia a la reducción presentada por el ABZ, aunque sólo en algunos casos se evidenciaron diferencias significativas (Tabla 8). Por otra parte, el metabolito ABZSO2, continuó presentado la misma tendencia observada en los demás tratamientos de cocinado, con aumentos extremadamente significativos en la cantidad de droga para todos los tiempos en ambas concentraciones (Tabla 9). Debido a que no hay ninguna molécula precursora, es imposible que la señal medida esté asociada a un incremento de la droga. Puesto que se descartó la posibilidad de que fuera debido a una interferencia del blanco de la matriz, nos lleva a pensar que tal vez se deba a una reacción de la molécula con algún componente del huevo durante el cocinado, o a alguna sustancia que pueda lixiviar del tubo de plástico, en el cual se cocinaron las muestras durante el hervido y el microondas, y que pudiera interactuar con la droga incrementando así la señal de la misma.
Se puede concluir que tanto ABZ como sus metabolitos ABZSO y ABZSO2, presentaron un comportamiento similar, siendo una droga relativamente estable frente a los diferentes tratamientos de cocinado. Estos resultados coinciden con estudios anteriores en los que se reportó una reducción del 6 % en los residuos de ABZ en músculo de vaca luego de someterlo a procedo de grillado, el cual se consideró despreciable en el contexto de seguridad alimentaria (Cooper et al, 2011). Otros, en cambio, obtuvieron resultados distintos con una reducción promedio de la droga en huevo sometido a proceso de fritura de 27,2% En el mismo trabajo, para el ABZSO, se evidenció una disminución de la concentración de residuos en huevo durante el hervido del 42,9% (Bistoletti, 2014). No obstante, en este último las condiciones del ensayo fueron diferentes, llevando a cabo la
43 evaluación de la estabilidad conjunta de ABZ y sus metabolitos en una misma muestra. Para el caso del ABZSO2, para la cual encontramos un incremento significativo de la droga, coincidimos con trabajos previos donde reportan un aumento promedio de ABZSO2 para huevo hervido de 107,5% (Bistoletti, 2014). Algo similar observó Cooper et al. (2011) para otras moléculas en músculo de vaca luego de someterlo a proceso de fritura. Los incrementos fueron del 27% al 29% para oxyclosanida y clorsulon, y se atribuyeron a una posible transformación de metabolitos no identificados durante la cocción.
En relación a la estabilidad de los residuos de FLBZ y sus metabolitos, FLBZ- R y FLBZ-H, en huevo cocinado mediante hervido, se observó que el FLBZ mostró una tendencia al aumento en la cantidad de la droga, aunque este no fue significativo desde el punto de vista estadístico, excepto, a los 5 min de cocción en la concentración alta (Tabla 10). En el caso del FLBZ-R, hubo una disminución estadísticamente significativa de la concentración de residuos tras el cocinado (Tabla 11). Por el contrario, los residuos de FLBZ-H no se modificaron tras dicho proceso (Tabla 12).
Al igual que se describió para ABZ/metabolitos, también para los residuos de FLBZ/metabolitos en huevo cocinado en microondas se observó una evidente deshidratación de la muestra (Figura 7A). Tanto FLBZ (Tabla 13), FLBZ-R (Tabla 14) como FLBZ-H (Tabla 15) presentaron una reducción de la cantidad de droga presente en la muestra siendo en la mayoría de los casos estadísticamente significativa.
El proceso de cocinado tipo tortilla también produjo deshidratación de la muestra, por lo que se llevó a cabo la corrección de la concentración (Figura 7B). Al igual que el cocinado al microondas, tanto los residuos de FLBZ (Tabla 16), FLBZ-R (Tabla 17) como FLBZ-H (Tabla 18) en huevo, disminuyeron tras el procesado tipo tortilla. Cuando hacemos la comparación estadística, dicha disminución, en general, fue extremadamente significativa, siendo el metabolito FLBZ-H el que presentó la mayor reducción (83%).
44 Podemos concluir que, en general, tanto los residuos de FLBZ droga madre como sus metabolitos no son estables en huevo frente a los distintos tratamientos de cocinado a los que fueron sometidos.
Como se mencionó, uno de los antibióticos comúnmente utilizados en la producción avícola es la EFX. En el presente trabajo llevamos a cabo la evaluación de la estabilidad de potenciales residuos de EFX y su metabolito CFX en huevo sometido a diferentes tipos de cocinado. Para ambas moléculas durante el proceso de hervido (Tabla 19) no se observó ningún cambio estadísticamente significativo en el nivel de residuos, a excepción de la CFX la concentración alta a los 45 min, la cual dio una disminución significativa, por lo que al ser un único dato se consideró como un valor “outlier” dentro del ensayo.
También para EFX y CFX durante el cocinado al microondas, como se muestra en la figura 7A, fue evidente la deshidratación del huevo con la consecuente concentración de los residuos. Las concentraciones de residuos cuantificadas en huevo después del cocinado en microondas tanto para EFX (Tabla 21) como en CFX (Tabla 22) no mostraron cambios significativos, a excepción de la concentración de CFX medida a los 30 s en ambos niveles (0,5 y 2 µg/g). Puesto que no hay una explicación lógica de un aumento de residuos, se consideraron datos outliers.
Cuando evaluamos la estabilidad de EFX y CFX en huevo cocinado tipo tortilla, también se pudo observar un marcado proceso de deshidratación de la muestra, por lo que, como se describió para otras moléculas, se llevó a cabo la corrección de la concentraciones (Figura 7B). En este tratamiento, la evolución de los residuos difirió entre la molécula madre EFX y su metabolito. Mientras que las concentraciones de EFX no evidenciaron cambios estadísticamente significativos, la CFX, mostró una clara tendencia al aumento de la concentración de residuos siendo este altamente significativo en la concentración alta (2 µg/g). Este fenómeno podría deberse, como comentamos anteriormente para los residuos de ABZSO2, a que a la señal de la molécula se esté sumando la de alguna sustancia
45 resultante de la reacción de la misma con algún compuesto del huevo durante el cocinado.
En general, podemos concluir que tanto los residuos de EFX como CFX en huevo son estables frente a los tres procesos de cocinado a los que fueron sometidos. Estos resultados coinciden con lo publicado por Lolo et al. (2006), quienes evaluaron la estabilidad de la EFX en pechuga, pata e hígado de pollo luego de someterla a tratamiento de hervido, freído, microondas y grillado, y obtuvieron como resultado la estabilidad de esta droga en agua (100°C, 3 h). Se observó una reducción en la concentración de la misma, aunque esta fue equivalente a la encontrada en el agua de hervido. También evidenciaron un incremento en la cantidad de residuo durante el grillado, esto fue atribuido a la pérdida de agua que sufrió la muestra durante la cocción, causando la concentración de la droga. En el presente trabajo, la muestra no estuvo en contacto con el agua de cocción, tampoco hubo liberación de fluidos durante el cocinado al microondas o en la sartén, por lo cual no fue necesario analizarlos. En relación a este último aspecto, algo similar reportó Papapanagiotou et al. (2004), en cuyo trabajo no se observaron fluidos liberados tras el cocinado de carne de cerdo con residuos de sulfametazina. Rose et al. (1997), coincidiendo con nuestro trabajo, evaluaron la estabilidad de lasalocid en huevos cocinados tipo omelette y revueltos y en ninguno de los dos casos se obtuvieron jugos para ser analizados.
Por el contrario, otros autores (Javadi et al., 2011) observaron una disminución de los residuos de EFX en distintas matrices como músculo, hígado y molleja de pollo durante el hervido y microondas. La mayor reducción se observó durante el grillado, lo cual se atribuyó al tiempo, la temperatura de cocinado (200°C, 40 min) y/o el método de detección utilizado, ya que no fue por HPLC, sino métodos microbiológicos. Similar a lo comentado anteriormente (Lolo et al. 2006), también encontraron residuos de la droga en los fluidos liberados durante la cocción. En el caso de la CFX, se reportan como residuos resultantes del metabolismo de EFX tras su administración, pero al ser estos niveles muy bajos o no cuantificables en
46 los distintos tejidos, no se evaluó la estabilidad de los mismos (Lolo et al., 2006; Javadi et al., 2011).
Cuando evaluamos la estabilidad de los residuos de la AMX en huevo cocinado mediante hervido (Figura 1 y 2) se observó una reducción de la droga proporcionalmente con el tiempo de cocción, que en promedio fue del 51,5%. Durante este tratamiento no hubo pérdida de agua en la muestra, por lo tanto no fue necesario recalcular las concentraciones.
En el proceso de cocinado al microondas también se evidenció una disminución de la molécula proporcionalmente con el tiempo (Figura 3 y 4). Similar a lo descrito para otras moléculas, tanto el cocinado del huevo en microondas como tipo tortilla produjo una evidente pérdida de agua de la muestra (Figura 7A y 7B). En el cocinado tipo tortilla, se observó la mayor reducción de la molécula (74%) (Figura 5 y 6).
Por lo tanto, los residuos de AMX en muestras de huevo no fueron estables después del cocinado, ya que hubo una reducción extremadamente significativa desde el punto de vista estadístico en los tres procedimientos llevados a cabo. Estos resultados difieren de lo reportado por Khattab et al. (2010), los cuales determinaron mediante el método de difusión en agar microbiológico, que la AMX era estable tanto en yema como en clara de huevo luego del hervido durante 10 min. No obstante, coincidiendo con el presente trabajo, se ha reportado inestabilidad para residuos de otros antibióticos como por ejemplo la clortetraciclina en huevo (Akram et al., 2012) y la tetraciclina en pechuga, muslo (Abou-Raya et al., 2012) e hígado de pollo (Al-Ghamdi et al., 2000) cuando estos alimentos son cocinados.
47 6. CONCLUSIONES
Las concentraciones de ABZ o ABZSO en huevo cocinado mediante hervido o en microondas no sufren cambios significativos, por lo que estas moléculas se consideran estables tras dichos procesos.
En el huevo con concentraciones de ABZ o ABZSO cocinado tipo tortilla se produce una disminución significativa de las mismas, por lo tanto dicho proceso afecta la disponibilidad de los residuos de estas moléculas.
Los potenciales residuos de FLBZ en huevo no se afectaron por el hervido, pero disminuyeron tras su cocinado en microondas o como tortilla.
Los metabolitos FLBZ-H y FLBZ-R en huevo disminuyen significativamente después del cocinado mediante hervido, microondas o tipo tortilla.
Los potenciales residuos de EFX en huevo no evidencian cambios significativos tras el cocinado mediante hervido, microondas o tipo tortilla, por lo que se considera una molécula estable tras dichos tratamientos.
Las concentraciones de CFX en huevo no cambian significativamente tras el cocinado mediante hervido o microondas, siendo estable a estos tratamientos.
Los potenciales residuos de AMX en huevo disminuyen significativamente tras el cocinado mediante hervido, microondas o tipo tortilla por lo que dichos proceso afectan su estabilidad.
El huevo con residuos de fármacos, cocinado mediante microondas o tipo tortilla produce un aumento en la concentración de los mismos proporcional al tiempo de cocinado, debido a la deshidratación sufrida por la muestra.
48
Los métodos convencionales de cocinado del huevo como hervido, microondas o tipo tortilla no pueden considerarse una herramienta para eliminar los residuos de antihelmínticos/antibacterianos que puedan aparecer en el huevo como consecuencia de tratamientos en gallina ponedora.
49 7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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