Tinciones histoquímicas

12.1.1.Parafina

Tras la eutanasia, los corazones se aíslan y fijan en una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% (p/v) en PBS pH=7,4 durante toda la noche en agitación. Posteriormente, los corazones se lavan en dos pasos de 20min con agua destilada y se deshidratan mediante una gradación creciente de alcoholes etílicos (Et30° 15min → Et50° 15min → Et70° 30min x4 → Et90° 15min x2 → Et96° 15min x2 → Et100° 15min x3). Para la inclusión en parafina, los corazones se sumergen en xileno (20min x2) y luego se incuban en parafina líquida (60°C) durante 2 horas y con 4 cambios de parafina. Finalmente, se monta el bloque de parafina con una orientación transversal o longitudinal del corazón.

Se realizan secciones seriadas de 10µm de grosor con un micrótomo RM2235 (Leica). Se incuban unos minutos en un baño de agua destilada a 37°C para estirar el tejido, se recogen con portaobjetos SUPERFROST PLUS (Thermo Scientific) y se dejan secar en una estufa a 37°C durante toda la noche.

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Para la realización de las tinciones histológicas, las secciones se desparafinan y rehidratan con el siguiente protocolo: xileno 10min x3 → Et100° 5min x2 → Et96° 5min → Et90° 5min → Et70° 5min → Et50° 5min → H2O destilada 5min. Se escogen las tinciones hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson para la observación general de las diferentes estructuras del tejido. También se realiza la tinción picrosirio para destacar las fibras de colágeno dentro del tejido[162]. Tras la tinción, las secciones se deshidratan en pasos crecientes de alcoholes (Et70° 2min → Et96° 10s → Et100° 20s) y se sumergen durante al menos 10min en xileno hasta su montaje con cubreobjetos en la solución DPX (Merck). Los protocolos de preparación de colorantes y tiempos de tinción se muestran en el Apéndice 33.

12.1.2.Criostato

Primero, 0,1mL de heparina sódica (5000U) se inyectan a los animales vía intraperitoneal. Transcurridos 5min, los animales se sacrifican, los corazones se perfunden con PBS durante 5min y luego con PFA al 0,5% en PBS pH=7,4 durante otros 5min. Posteriormente, los corazones se extraen y post-fijan en PFA al 1% en PBS pH=7,4 en agitación suave durante toda la noche a 4°C. Tras el proceso de fijación, los corazones se lavan con agua destilada en dos pasos de 30min en agitación para luego ser inmersos en sendas soluciones de sacarosa, una al 10% (p/v) durante 30min y luego otra al 20% (p/v) durante toda la noche a 4°C. Este proceso iguala la osmolaridad del tejido a la solución de inclusión, lo que permite una criopreservación más homogénea del tejido. Finalmente, las muestras se incluyen en O.C.T. (Tissue-Tek®_{) y se criopreservan en isopropanol enfriado}

Material y Métodos

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mediante nitrógeno líquido. Las muestras se conservan a -80°C hasta su uso.

Se realizan secciones de 7µm de grosor en un criostato CM3050 S (Leica), se recogen con portaobjetos SUPERFROST PLUS

(Thermo Fisher Scientific), se secan a temperatura ambiente durante 1min y se guardan a -80°C hasta su uso. Posteriormente, se realiza la tinción histoquímica Oil Red, que permite destacar los lípidos presentes en la muestra. Las secciones criopreservadas son adecuadas para este tipo de tinciones, puesto que permiten la conservación de los lípidos en el tejido. La preparación del colorante y el protocolo de tinción se detallan en el Apéndice 33. Tras la tinción, los portaobjetos se montan con un medio de montaje acuoso, formado por una mezcla de Glicerina:PBS en proporción 1:1.

Todas las imágenes de tinciones histoquímicas se toman mediante un microscopio Eclipse 50i (Nikon) con una cámara DS2-Mv y se procesan por el software NIS-Elements BR3.0 software (Nikon).

12.2. Inmunofluorescencia

12.2.1.De tejido

Todas las tinciones de inmunofluorescencia se realizan sobre secciones criopreservadas (su obtención y procesado ha sido descrito previamente). En el caso de que se realice un desenmascaramiento del epítopo, las secciones se sumergen en tampón citrato 1% pH=6 (Apéndice 34) y se hierven durante 15min en microondas. Tras dejar enfriar a temperatura ambiente

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durante >15min, las secciones se lavan 3 veces en PBS para equilibrar de nuevo su pH.

Los cortes se incuban entonces con una solución de bloqueo [5% FBS y 0,5% (p/v) Triton-X-100 en PBS] durante 1 hora en cámara húmeda a temperatura ambiente. Después del bloqueo, las secciones se incuban toda la noche a 4°C con los anticuerpos primarios correspondientes diluidos en solución de bloqueo (Ver Apéndice 36). Tras su incubación, se realizan 3 lavados consecutivos de PBS en agitación durante 3min cada uno y se incuba con los anticuerpos secundarios correspondientes (anti-ratón o anti-conejo) conjugados con los fluorocromos Cy2 o Cy3 (Amersham PA43002-43002; PA43004- 42004, respectivamente) durante 1h a temperatura ambiente en cámara húmeda. Entonces las secciones se lavan 3 veces en PBS durante 3min en agitación. En el caso de que se trate de una inmunofluorescencia doble, las secciones se incuban con los anticuerpos primarios anti-DES o anti-PKP2 (Ver Tabla 11 Apéndice 36) durante 1h a temperatura ambiente. Posteriormente, se lavan 3 veces con PBS durante 3min en agitación y las secciones se incuban con los anticuerpo secundarios correspondientes anti-ratón conjugado a Cy2 (para PKP2) o con alexa fluor 647 anti-cabra (para DES) (Invitrogen; cat: A-21447) 1h a temperatura ambiente. Luego, se incuban con 4′,6-Diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI, Sigma- Aldrich; cat: 32670) a una concentración de 5µg/mL durante 10min. Finalmente, tras 4 lavados en PBS durante 3min cada uno, los cortes se montan con el medio de montaje de base acuosa Fluoromount (Sigma-Aldrich). Para el visionado y la toma

Material y Métodos

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de fotos de las muestra se usa un microscopio confocal (Nikon A1R).

12.2.2.Fluorescencia en células

La detección de la proteína Ruby se realiza mediante fluorescencia de la muestra, sin necesidad del uso de un anticuerpo. Las células se siembran en placas de 24 pocillos sobre cubreobjetos estériles y previamente tratados con la mezcla de coating compuesta por gelatina 0,02% y fibronectina 5µg/mL en PBS. Tras la incubación de las células transducidas durante 24h, estas se tratan con DOX (+/-) a una concentración final de 2µg/mL. Las células se incuban durante toda la noche a 37°C, 100% de humedad y CO2 al 5% para luego retirar el medio de cultivo y lavar las células 3 veces con PBS. Las células se fijan con PFA al 2% en PBS en oscuridad y a 4°C durante 15min. Posteriormente se vuelven a lavar 3 veces con PBS, se incuban con DAPI (Sigma-Aldrich) a 5µg/mL durante 5min y se vuelven a lavar con PBS. Finalmente, las células se montan en un porta objetos mediante el medio de montaje Fluoromount (Sigma- Aldrich) y se visualiza en un microscopio Eclipse 50i (Nikon) mediante fluorescencia con un filtro TRTC (para visualizar Ruby) y un filtro 405nm (para visualizar DAPI).