Tipificación molecular de los aislamientos con determinantes de RPFQs

La relación clonal entre las cepas portadoras de genes codificantes de RPFQs se determinó mediante diferentes métodos de tipificación molecular.

4.1. REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic-PCR)

La REP-PCR utiliza oligonucleótidos diseñados a partir de secuencias palindrómicas extragénicas altamente conservadas y que se repiten a lo largo del

genoma (Stern, 1984). La técnica se basa en que este tipo de secuencias se encuentran

dispersas en el cromosoma, presentando orientaciones diferentes y separadas por distancias variables. La amplificación se realizó a partir de ADN total, los

oligonucleótidos empleados se muestran en la Tabla 16 y las condiciones de PCR

fueron las siguientes: desnaturalización a 95°C (5 min), 30 ciclos de 95°C (30 s), 52°C

(30 s) y 72°C (1 min), y una extensión final a 72°C (5 min).

Tabla 16. Oligonucleótidos utilizados en la REP-PCR.

Gen Oligonucleótido (secuencia 5’  3’)

REP-1 IIIGCGCCGICATCAGGC

REP-2 ACGTCTTATCAGGCCTAC

Esta técnica de tipificación molecular se caracteriza por su simplicidad (no requiere el uso de enzimas de restricción, ni técnicas electroforéticas especiales), rapidez (menos de 24 horas) y su relativo bajo coste. Los patrones de bandas suelen

ser sencillos, como en Acinetobacter baumannii, aunque en otros microorganismos,

como E. coli, la interpretación de los patrones es algo más dificultosa, debido a la

proximidad que existe entre algunas bandas y al mayor número de bandas. Esta técnica posee un poder de discriminación y reproducibilidad inferiores a los de la PFGE,

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aunque para algunas bacterias, como A. baumannii, se ha visto que la REP-PCR

presenta un poder de discriminación similar al de la PFGE (Fernández-Cuenca, 2004).

4.2. ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR)

La ERIC-PCR utiliza oligonucleótidos diseñados a partir de secuencias consenso

repetitivas intragénicas de enterobacterias (secuencias ERIC) (Fernández-Cuenca, 2004). La

amplificación se realizó a partir de ADN total y los oligonucleótidos empleados se

muestran en la Tabla 17. Las condiciones de PCR fueron las siguientes:

desnaturalización a 95°C (3 min), 35 ciclos de 95°C (30 s), 51°C (1 min) y 72°C (2 min), y

una extensión final a 72°C (5 min). La amplificación de secuencias ERIC proporciona

patrones de bandas que suelen ser menos complejos que los generados mediante REP-

PCR (Fernández-Cuenca, 2004).

Tabla 17. Oligonucleótidos utilizados en la ERIC-PCR.

Gen Oligonucleótido (secuencia 5’  3’)

ERIC 1 ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC

ERIC-2 AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG

4.3. RFLP-PFGE (Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción Electroforesis en campo pulsante)

La RFLP-PFGE es la técnica de referencia en la caracterización clonal de microorganismos. Posee un elevado poder de discriminación y una excelente

reproducibilidad (Van Belkum, 1994). El principal inconveniente de esta técnica de

tipificación molecular es que es muy laboriosa y larga, ya que la mayoría de los protocolos requieren más de 4 días para poder obtener y analizar los patrones de

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bandas (Fernández-Cuenca, 2004). En este trabajo, se utilizó el método descrito por

Gautom (Gautom, 1997), con ligeras modificaciones, que brevemente se describen a

continuación.

 Extracción del ADN

A partir de una resiembra de los aislamientos en el medio de cultivo sólido agar

Mueller-Hinton (MH) (bioMérieux, La Balme Les Grottes, France) se realizó la

extracción del ADN con el siguiente protocolo:

- Se resuspendieron de 3 a 4 colonias en un tubo falcon de pico que contenía 3

mL de tampón de lavado SE [75 mM NaCl (pH 8), 25 mM EDTA (pH 8)].

- A continuación, se centrifugó a 13000 rpm durante 15 min, se descartó el

sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 3 mL de tampón de lavado SE.

- Se repitió la centrifugación, se descartó de nuevo el sobrenadante y se

resuspendió el sedimento en 3 mL de tampón de lavado SE.

- Finalmente, se ajustó la concentración celular bacteriana mediante

espectrofotómetro, obteniendo un valor de densidad óptica entre 1.4 y 1.5 a una longitud de onda de 600 nm.

 Elaboración de bloques de agarosa

Para elaborar los bloques de agarosa se tomaron 500 µL de la solución celular bacteriana ajustada a un tubo eppendorf de 1.5 mL. A continuación, se añadieron 500 µL de agarosa para bloques al 1.2% fundida. Se mezcló muy bien y rápidamente se vertió la mezcla en los moldes. La cantidad de mezcla resultante (1 mL) nos permitió realizar dos bloques por cada muestra. Para facilitar la solidificación de los bloques, se

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 Lisis celular

La lisis celular se llevó a cabo en tubos falcon de 50 mL en los que se añadieron

los bloques y a continuación 3 mL del tampón de lisis [50 mM de Tris-HCl (pH 8), 50

mM EDTA (pH 8), 1% SarKosyl] y 1 mg/mL (150 µL) de proteinasa-K (20 mg/mL)

(Promega®). Los tubos se incubaron a 50°C en baño durante aproximadamente 20

horas.

 Lavados de los bloques

Con el fin de eliminar posibles interferencias tras el proceso de lisis celular, se realizaron 5 lavados de los bloques a temperatura ambiente:

1º Lavado: 3 mL de agua destilada durante 5 min.

2º Lavado: 3 mL de tampón TE [10mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA (pH 8)]

durante 5 min.

3º, 4º y 5º Lavado: 3 mL de tampón TE durante 20 min.

En esta etapa era posible detener el procedimiento manteniendo los bloques lavados

en tampón TE a 4°C.

 Digestión del ADN con enzima de restricción

La digestión del ADN se realizó con el enzima de restricción SpeI (10U/µL)

(Promega®), que es un enzima de baja frecuencia de corte. Para ello, se cortó un fragmento del bloque (aproximadamente medio cm o menos) y se añadió en un tubo eppendorf de 1.5 mL, que contenía 200 µL del tampón a concentración 1x del enzima de restricción (10 µL BSA, 100 µL de tampón 10x y 890 µL de agua destilada). Se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación, se retiró este

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tampón y se añadieron de nuevo 200 µL del tampón 1x. Finalmente, se añadieron

lentamente 5 µL (50U) del enzima SpeI. Es importante mantener el enzima en hielo

durante todo el proceso. Para mejorar la eficacia de corte del enzima se añadieron en primer lugar 3 µL y tras 2 horas y 30 min de incubación el resto.

 Electroforesis en campo pulsante

Se preparó un gel de agarosa al 1% en tampón TBE (Tris/Borate/EDTA) a una concentración 0.5x. Una vez solidificado, se introdujo en cada pocillo del gel el fragmento de bloque correspondiente. A continuación, se rellenó el espacio libre de cada pocillo con agarosa al 1%. Finalmente, se separaron los fragmentos digeridos por el enzima de restricción usando una unidad de CHEF-DR™ II (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Las condiciones electroforéticas fueron las siguientes:

 Temperatura: 14 °C

 Pulsos de tiempo: intervalos desde 2.2 a 54.2 s

 Voltaje: 6 V/cm

 Tiempo: 20 horas

 Tinción del gel y revelado

Para la tinción de los fragmentos obtenidos, sumergimos el gel en una solución de bromuro de etidio en tampón TBE 0.5x a una concentración de 0.5 µg/mL durante 15-20 min, a temperatura ambiente y protegido de la luz. A continuación, se lavó el gel en tampón TBE 0.5x durante 20 min y se visualizó en un transiluminador de luz ultravioleta.

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 Lectura e interpretación de los resultados

La lectura e interpretación de los patrones de bandas obtenidos se llevó a cabo sobre la fotografía del gel según los criterios definidos por Tenover y colaboradores (Tenover, 1995). Mediante esta técnica se compara la similitud genética de una serie de cepas, de modo que para la interpretación de los resultados comparamos cada cepa con el resto de la serie. Una banda de diferencia se interpreta como relación clonal, dos bandas de diferencia como posiblemente relacionados y un número mayor de tres bandas distintas se interpreta como aislados no relacionados clonalmente.