ANEXO V. Métodos de ensayo
51,2 54,9 Valor experimental (mN/m):
B.5. TOXICIDAD AGUDA (IRRITACIÓN OCULAR) 1 MÉTODO
1.1. INTRODUCCIÓN
Véase la introducción general de la parte B (punto A). 1.2. DEFINICIÓN
Véase la introducción general de la parte B (punto B). 1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA
Ninguna.
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO Consideraciones iniciales
Se procurará tener en cuenta escrupulosamente toda información disponible sobre una sustancia para reducir al mínimo las pruebas de sustancias en condiciones que, probablemente, vayan a producir reacciones graves. Puede ser útil a este respecto disponer de la siguiente información:
i) Propiedades fisicoquímicas y reactividad química. Las sustancias que sean ácidos o bases fuertes (pH en el ojo demostrado igual o inferior a 2 o igual o superior a 11,5, por ejemplo) no necesitarán someterse a prueba si son de esperar lesiones graves. Debe tenerse también en cuenta la reserva ácida o básica.
ii) Resultados de estudios alternativos validados. Las sustancias que hayan mostrado propiedades potencialmente corrosivas o gravemente irritantes no tienen que someterse a la prueba de irritación ocular, ya que se supone que estas sustancias producirían efectos graves en los ojos si se siguiera este método.
iii) Resultados de estudios de irritación de la piel. Las sustancias que hayan mostrado claras propiedades corrosivas o hayan producido irritación grave de la piel en un estudio de irritación de la misma no tienen que someterse al ensayo de irritación ocular, ya que se supone que estas sustancias pueden producir efectos graves en los ojos.
Se aplica la sustancia de ensayo, en una dosis única, a un ojo de cada uno de varios animales de laboratorio; el ojo no tratado se utiliza como testigo. Se observa la importancia de la reacción de irritación y se valora a intervalos determinados; se hará una descripción detallada con el fin de permitir una evaluación completa de los efectos. El período de observación debe ser suficientemente largo para poder evaluar completamente el carácter reversible o irreversible de los efectos observados.
Los animales que muestren signos graves y duraderos de angustia o dolor deberán ser sacrificados de forma humanitaria. 1.5. CRITERIOS DE CALIDAD
Ninguno.
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO 1.6.1. Preparación
Deben examinarse los dos ojos de cada animal seleccionado provisionalmente para el ensayo durante las 24 horas que preceden al mismo. No se utilizarán aquellos animales en los que se observe irritación ocular, defectos oculares o una lesión de córnea ya existente.
1.6.2. Condiciones del ensayo 1.6.2.1. Animales de laboratorio
Aunque se hayan utilizado otros animales diferentes, se recomienda efectuar el ensayo en conejos albinos adultos y sanos. 1.6.2.2. Número de animales
Se considerará la posibilidad de hacer un ensayo en un único animal, si se prevé efectos graves. Si el resultado de este ensayo en un conejo sugiere que la sustancia es gravemente irritante (efecto reversible) o corrosiva (efecto irreversible) para el ojo utilizando el procedimiento descrito, puede no ser necesario realizar ensayos adicionales de irritación ocular en otros animales. En ocasiones, puede ser adecuado hacer ensayos en animales adicionales para investigar aspectos específicos.
Cuando no se utilice un único animal, se utilizarán por lo menos tres animales. Puede resultar necesario utilizar un mayor número de animales para precisar las respuestas dudosas.
1.6.2.3. Dosis
Si la sustancia de ensayo es un líquido, se utiliza un volumen de 0,1 ml. En cuanto a las sustancias sólidas, pastosas y en forma de partículas, la cantidad que se utilice debe tener un volumen de 0,1 ml o pesar alrededor de 0,1 g (siempre debe anotarse el peso). Si la sustancia de ensayo es sólida o granulosa debe ser triturada en polvo fino. La medida del volumen de las sustancias en forma de partículas debe ir precedida de una compresión ligera, por ejemplo, dando golpecitos al recipiente de medida.
Para las sustancias contenidas en pulverizadores o en recipientes de aerosoles a presión, debe expelerse el líquido y recoger y depositar 0,1 ml en el ojo, como se describe en el caso de los líquidos.
1.6.2.4. Período de observación
La duración del período de observación no debe fijarse de forma rígida y debe ser suficiente para poder evaluar el carácter reversible o irreversible de los efectos observados, aunque normalmente no debe superar los 21 días, a contar desde la instilación.
1.6.3. Procedimiento
Los animales deben estar alojados en jaulas individuales. La sustancia de ensayo debe instilarse en el saco conjuntival de uno de los ojos de cada animal, después de haber separado delicadamente el párpado inferior del globo ocular, y a continuación se juntan los párpados con cuidado durante un segundo más o menos para evitar que la sustancia salga. El otro ojo que no se trata sirve de testigo.
Si se piensa que la sustancia puede producir un dolor desproporcionado, se usará un anestésico local antes de la instilación de la sustancia de ensayo. El tipo, concentración y tiempo de aplicación del anestésico local deben seleccionarse cuidadosamente para garantizar que su uso no produzca diferencias significativas en la reacción a la sustancia de prueba. Debe anestesiarse de forma similar el ojo testigo.
No deben lavarse los ojos de los animales durante las 24 horas siguientes a la instilación de la sustancia de ensayo. Si es necesario, puede hacerse un lavado al final de dicho período.
Puede estar indicado realizar ensayos adicionales con conejos a los que se les hace un lavado de ojos poco tiempo después de la instilación de la sustancia, en el caso de aquellas sustancias que hayan demostrado su carácter irritante en el ensayo citado anteriormente. En estos casos, se recomienda utilizar 3 conejos. Medio minuto después de la instilación, los ojos de los conejos se lavan durante medio minuto, utilizando un volumen y una velocidad de salida del líquido que no produzca lesiones.
1.6.3.1. Observación y graduación
Los ojos deben examinarse después de 1, 24, 48 y 72 horas. Si no hay evidencia de lesiones oculares al cabo de 72 horas, se puede poner fin al ensayo.
Puede resultar necesario una observación prolongada en caso de daños persistentes en la córnea o de cualquier otra irritación ocular con el fin de determinar la evolución de las lesiones y su carácter reversible o irreversible. Además de las observaciones relativas a la córnea, al iris y a la conjuntiva, es conveniente registrar y describir todas las lesiones que se observen. La valoración de la reacción ocular (véase la tabla) debe registrarse en cada examen. (La valoración de las reacciones oculares puede dar lugar a diversas interpretaciones; como ayuda, los laboratorios de investigación y las personas encargadas de efectuar o de interpretar las observaciones, pueden recurrir a una guía ilustrada que trate de las irritaciones oculares.)
Para facilitar el examen de las reacciones, se puede utilizar una lupa binocular, una lámpara manual de hendidura, un biomicroscopio u otro instrumento adecuado. Después de registrar las observaciones efectuadas al cabo de 24 horas, puede proseguirse el examen de los ojos de algunos conejos o de todos ellos por medio de fluoresceína.
2. RESULTADOS
Los resultados deben inventariarse en un cuadro que recoja, para cada animal, los índices de irritación en el momento de cada observación. Hay que indicar una descripción del grado y naturaleza de la irritación, la presencia de lesiones graves y cualquier otro efecto no ocular que se observe.
3. INFORME
3.1. INFORME DEL ENSAYO
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:
–datos sobre los animales (especie, cepa, origen, condiciones ambientales, régimen alimentario, etc.), –condiciones del ensayo (incluidas las propiedades fisicoquímicas de la sustancia que sean oportunas),
–tabla de resultados de la reacción de irritación o corrosión en cada animal y en cada momento de observación (por ejemplo, 1, 24, 48 y 72 horas),
–descripción de cualquier lesión grave observada,
–descripción narrativa del grado y naturaleza de la irritación o la corrosión observadas, incluidas la zona de córnea afectada y su reversibilidad,
–descripción del método utilizado para graduar la irritación después de 1, 24, 48 y 72 horas (por ejemplo, lámpara manual de hendidura, biomicroscopio, fluoresceína),
–descripción de cualquier efecto local no ocular que se observe, –discusión de los resultados,
–interpretación de los resultados.
3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACION
Véase la introducción general de la parte B (punto D). 4. BIBLIOGRAFÍA
Véase la introducción general de la parte B (punto E). Apéndice
TABLA: GRADUACIÓN DE LAS LESIONES OCULARES
Valor
Córnea
Opacidad: grado de densidad (Las observaciones se efectuarán en las zonas más densas)
Sin ulceración ni opacidad 0
Zonas de opacidad (distintas a un ligero empañamiento del brillo normal) dispersas o difusas, detalles del iris netamente visibles
1
Zona traslúcida fácilmente discernible, detalles del iris ligeramente oscurecidos
2
Zona nacarada, detalles del iris completamente invisibles, tamaño de la pupila apenas discernible
3
Córnea opaca, iris no discernible a través de la opacidad
4
Iris
Normal 0
Pliegues netamente más profundos, congestión, tumefacción, hiperemia pericorneal moderada o conjuntiva inyectada, cualquiera de estos síntomas o cualquier combinación de varios de ellos, el iris continúa reaccionando a la luz (una reacción lenta es positiva)
1
Ausencia de reacción a la luz, hemorragia, destrucción marcada (cualquiera de los síntomas o todos ellos en conjunto)
2
Conjuntiva
Enrojecimiento (se aplica a la parte más afectada de las conjuntivas palpebral y ocular, en relación con el ojo de control)
Vasos sanguíneos normales 0
Neta hiperemia de algunos vasos sanguíneos (ojos inyectados)
Coloración carmesí difusa, vasos sanguíneos individuales difícilmente discernibles
2
Coloración roja fuerte y difusa 3
Quemosis: párpados o membranas nictitantes
Sin tumefacción 0
Cualquier tumefacción superior a la normal (incluidas las membranas nictitantes)
1
Tumefacción evidente con eversión parcial de los párpados
2
Tumefacción con párpados medio cerrados
3
Tumefacción con párpados casi cerrados 4 B.6. SENSIBILIZACIÓN DE LA PIEL 1. MÉTODO 1.1. INTRODUCCIÓN Observaciones:
La sensibilidad y capacidad de los ensayos para detectar sustancias potencialmente sensibilizantes de la piel humana se consideran importantes en un sistema de clasificación de la toxicidad aplicable a la salud pública.
No hay un método único que detecte todas las sustancias con potencial de sensibilización de la piel humana y que sea adecuado para todas las sustancias.
Para seleccionar un ensayo deben tenerse en cuenta factores como las características físicas de una sustancia, incluyendo en ellas la capacidad de penetración de la piel.
Los ensayos que utilizan cobayas pueden subdividirse en ensayos con adyuvante, en las que se potencia un estado alérgico disolviendo o suspendiendo la sustancia de ensayo en adyuvante completo de Freunds (FCA), y en ensayos sin adyuvante.
Es posible que los ensayos con adyuvantes sean más exactos, a la hora de predecir el efecto sensibilizante que una sustancia puede tener en la piel humana, que los métodos que no utilizan FCA; son, pues, los métodos preferidos.
El ensayo de maximización en cobayas (GPMT) es un ensayo con adyuvante ampliamente utilizado. Aunque se pueden utilizar algunos otros métodos para detectar el potencial sensibilizante de una sustancia, se considera a la GPMT como la técnica con adyuvante de preferencia.
Los ensayos sin adyuvantes (suele utilizarse sobre todo el ensayo de Buehler) se consideran menos sensibles con muchas clases de químicos.
En ciertos casos, puede haber buenas razones para escoger el ensayo de Buehler, que implica una aplicación tópica, antes que la inyección intradérmica utilizada en la GPMT. Cuando se use el ensayo de Buehler habrá que justificarlo desde el punto de vista científico.
Se describen en este método el ensayo de maximización en cobayas (GPMT) y el ensayo de Buehler. Se pueden utilizar otros métodos siempre que estén bien validados y que se dé su justificación científica.
Independientemente del método que se utilice, debe controlarse a intervalos regulares (seis meses) la sensibilidad de la cepa de cobayas utilizada para probar la sensibilización de la piel; para ello se usará un sensibilizante conocido, suave y moderado, y deberá obtenerse un número satisfactorio de respuestas positivas.
Véase también la introducción general de la parte B (punto A). 1.2. DEFINICIÓN
Véase la introducción general de la parte B (punto B). 1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA
Se recomiendan las sustancias siguientes, diluidas como sea necesario, así como cualquier otra sustancia activa sensibilizadora, conocida en la bibliografía, o que pertenezca al grupo de la sustancia que se estudia.
–p-fenilendiamina núm. CAS 106-50-3 –2,4-dinitroclorobenceno núm. CAS 97-00-7 –dicromato potásico núm. CAS 7778-50-9 –sulfato de neomicina núm. CAS 1405-10-3 –sulfato de níquel núm. CAS 7786-81-4 1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO
Después de una exposición inicial a la sustancia de ensayo (período de inducción) se somete a los animales, aproximadamente dos semanas después de la última exposición de inducción, a una exposición de provocación a la sustancia con el fin de establecer si se ha inducido un estado de hipersensibilidad. La sensibilización se determina examinando la
respuesta cutánea a la exposición de provocación. 1.5. CRITERIOS DE CALIDAD
Ninguno.
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
1.6.1. Prueba de maximización en cobayas (GPMT) 1.6.1.1. Preparación
Se eligen al azar cobayas albinos jóvenes y sanos y se reparten en lotes tratados y lotes testigo. Antes de administrar la sustancia, se esquila o se rasura el pelo de la región dorsal superior procurando no dañar la piel.
1.6.1.2. Condiciones del ensayo 1.6.1.2.1. Animales de laboratorio
Se utilizan cepas corrientes de laboratorio de cobaya albino, con peso individual inferior a 500g. 1.6.1.2.2. Número y sexo
Se pueden utilizar animales de ambos sexos. Si se utilizan hembras deben ser nulíparas y no grávidas. Se utilizan por lo menos 10 animales para el lote tratado y 5, por lo menos, para el lote testigo. Si se utiliza un número menor de animales, se debe explicar la razón. Si se obtienen resultados dudosos, se decidirá si se repite el ensayo con otro lote de animales, según el examen histopatológico. Cuando no sea posible concluir definitivamente si la sustancia es o no es sensibilizante, se recomienda utilizar animales adicionales, hasta llegar, al menos, a un total de 20 animales con la sustancia de ensayo y 10 animales control.
1.6.1.2.3. Dosis
La concentración de la sustancia se ajusta a un nivel que produzca cierta evidencia de irritación de la piel pero que los animales puedan tolerar bien en cada fase de inducción.
La concentración de provocación será la máxima que no induzca irritación cutánea alguna en los animales no sensibilizados. Estas concentraciones pueden determinarse mediante un estudio preliminar reducido (2 ó 3 animales).
1.6.1.2.4. Período de observación
Durante el período de inducción, se observa la piel para controlar los posibles efectos irritantes. Después de la exposición de provocación, se registran las reacciones cutáneas, 24 y 48 horas después de quitar el apósito.
1.6.1.3. Procedimiento
Se pesan los animales antes de empezar y al terminar el ensayo. Se rasura el pelo de la región dorsal superior. El procedimiento consta de dos fases:
1.6.1.3.1. Inducción Día 0-grupo tratado
Las inyecciones intradérmicas, cada una de 0,1 ml, que a continuación se indican se ponen por pares en el dorso superior, de forma que una de las inyecciones del par se sitúe a un lado de la línea media y la otra en el opuesto:
Inyección 1: 0,1 ml de adyuvante completo de Freunds (FCA) mezclado con agua o suero fisiológico 1:1, Inyección 2: 0,1 ml de sustancia de ensayo, en un vehículo adecuado, si fuera necesario,
Inyección 3: 0,1 ml de sustancia de ensayo en FCA.
En la inyección 3, las sustancias hidrosolubles se disuelven en 0,05 ml de agua y 0,05 ml de FCA no diluido. Si se ensayan sustancias liposolubles o insolubles, se mezclan con FCA no diluido.
En la inyección 3, la concentración final de la sustancia de ensayo será igual que la de la inyección 2.
Las inyecciones 1 y 2 se hacen próximas una de la otra y lo más cerca posible de la cabeza, mientras que la inyección 3 se sitúa hacia la parte caudal de la superficie de ensayo.
Día 0-lote testigo
Las inyecciones intradérmicas siguientes se ponen por pares en los mismos lugares citados: Inyección 1: 0,1 ml de FCA mezclado con agua o suero fisiológico 1:1;
Inyección 2: 0,1 ml de vehículo solo; Inyección 3: 0,1 ml de vehículo en FCA. Sexto día-lotes tratados y testigo
Si la sustancia no es irritante para la piel, se pincela la zona de ensayo, tras esquilarla y/o rasurarla, con 0,5 ml de laurisulfato sódico al 10% en vaselina, para crear irritación local.
Séptimo día-lote tratado
Se elimina de nuevo el pelo de la zona de ensayo. Por medio de un vehículo adecuado se vierte la sustancia (debe justificarse la elección del vehículo; los sólidos, pulverizados finamente, se incorporan a un vehículo adecuado; los líquidos se pueden aplicar directamente) sobre un papel de filtro ( 2 ? 4 cm) que se aplica sobre la superficie de ensayo y se mantiene en contacto con la zona de ensayo mediante un apósito oclusivo durante 48 horas.
Séptimo día-lote testigo
Se elimina de nuevo el pelo de la zona de ensayo. Se aplica sólo el vehículo, sobre la zona de ensayo, según el mismo método, y se mantiene en contacto con la piel mediante un vendaje oclusivo durante 48 horas.
1.6.1.3.2. Provocación Vigésimo primer día
Se elimina el pelo de los costados de los animales tratados y de los testigos. Se aplica un apósito o una cámara con sustancia de ensayo sobre un costado de los animales tratados, mientras que en el otro costado se les aplica un apósito o una cámara únicamente con vehículo.
Los apósitos se mantienen en contacto con la piel mediante un vendaje oclusivo durante 24 horas. Se somete el grupo testigo a la misma manipulación.
–21 horas después de haber levantado el apósito se limpia de pelo si fuera necesario la superficie sometida a ensayo, –3 horas más tarde (48 horas después de comenzar la aplicación de provocación) se observa y registra la reacción cutánea, –24 horas después de esta observación, se procede a una segunda observación (72 horas) que se registra.
Para precisar los resultados obtenidos en esta primera fase de provocación, se puede programar una segunda, si fuera necesario con un nuevo grupo testigo para el vehículo, más o menos una semana después de la primera fase.
1.6.1.3.3. Observaciones y graduación
Todas las reacciones cutáneas y todas las observaciones no habituales que se deriven de las fases de inducción y de provocación deben registrarse y consignarse en el informe.
Pueden utilizarse técnicas como el estudio histopatológico o la medida del espesor del pliegue cutáneo para aclarar reacciones o respuestas dudosas, enmascaradas por la tinción de la piel por la sustancia de ensayo.
1.6.2. Ensayo de Buehler 1.6.2.1. Preparativos
Se eligen al azar cobayas albinos jóvenes y sanos y se reparten en lotes tratados y lotes testigo. Antes de administrar la sustancia, se esquila y/o se rasura el pelo de un costado, procurando no dañar la piel.
1.6.2.2. Condiciones del ensayo 1.6.2.2.1. Animales de laboratorio
Se utilizan cepas de cobayas albinos usadas corrientemente en laboratorios, con peso individual menor de 500 g. 1.6.2.2.2. Número y sexo
Pueden usarse animales de ambos sexos. Si se utilizan hembras, deberán ser nulíparas y no grávidas. Se usarán al menos 20 animales en el lote tratado y al menos 10 en el lote testigo. Si se utiliza un número menor de animales, deberá explicarse la razón. Si se obtienen resultados dudosos, se decidirá si se repite el ensayo, con otro lote de animales, según el examen histopatológico.
1.6.2.2.3. Dosis
La concentración de la sustancia de ensayo, en cada fase de inducción se ajusta al nivel máximo que tenga buena tolerancia sistémica y que, en cuanto a las sustancias irritantes, produzca irritación moderada o leve en la mayoría de los animales de ensayo. La concentración de provocación será la máxima que no produzca señales de irritación cutánea en animales no sensibilizados. Estas concentraciones pueden determinarse mediante un estudio preliminar reducido (2 ó 3 animales).
1.6.2.2.4. Período de observación
Durante el período de inducción, se observa la piel para controlar los efectos irritantes. Después de la exposición de provocación, se registran las reacciones cutáneas 24 y 48 horas después de quitar el apósito, es decir, 30 y 54 horas después del comienzo de la aplicación.
1.6.2.3. Procedimiento
Se pesan los animales antes de empezar y al terminar el ensayo. El procedimiento consta de dos fases:
1.6.2.3.1. Inducción Día 0-lote tratado
Se elimina el pelo de un costado. Por medio de un vehículo adecuado (debe justificarse la elección del vehículo, los líquidos