Toxicidad de cetonas de Tagetes minuta : dos casos de estudio

Se describen a continuación y brevemente dos estudios de toxicidad realizados con fracciones de aceite de Tagetes minuta obtenidas durante el trabajo experimental de esta tesis, mediante fraccionamiento supercrítico, frente a dos parásitos de interés agronómico e industrial: (a) el gorgojo del maíz o Sitophilus zeamais y (b) el nemátodo Meloidogyne javanica. Los resultados aquí presentados pretenden confirmar el incremento en la actividad biocida obtenido al concentrar la fracción de monoterpenos oxigenados

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(cetonas) y validar el fraccionamiento con fluidos super-críticos como técnica adecuada y eficiente para lograr dicha mejora.

a) Actividad biocida frente al gorgojo de maíz

El control de plagas que atacan productos almacenados (granos, frutos, alimentos procesados o semi-procesados) constituye un importante campo de acción para los bioplaguicidas, en el que se busca crear nuevas prácticas de baja toxicidad para mamíferos y baja persistencia en el ambiente [68],[69].

El gorgojo del maíz (Sitophilus zeamais Motschulsky) es una severa plaga que ataca el maíz almacenado, causando importantes pérdidas cuantitativas y cualitativas de producto a nivel mundial. Actualmente, el control de esta plaga se basa en el uso de insecticidas sintéticos (principalmente bromuro de metilo).

En este estudio, se evaluó el efecto fumigante de varios aceites esenciales ricos en cetonas sobre este insecto. Dentro de ese marco, se estudió la toxicidad del aceite de

Tagetes minuta y de la fracción de ocimenonas aislada a partir del aceite por medio de fraccionamiento con CO2 supercrítico. Los resultados fueron obtenidos en el Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal (IMBIV, Universidad Nacional de Córdoba – CONICET) como parte del trabajo doctoral de Jimena Herrera, bajo la supervisión del Dr. Julio Zygadlo, y se encuentran en proceso de publicación [70].

Los aceites esenciales utilizados en este estudio fueron obtenidos por hidrodestilación y caracterizados por cromatografía de gases (GC-MS).

Las cetonas puras -tuyona, R-carvona, S-carvona, (–)-mentona y R-pulegona fueron adquiridas en Sigma Aldrich (Steinheim, Alemania).

La fracción de ocimenonas utilizada fue aislada a partir del aceite de T. minuta por fraccionamiento semi-continuo con CO2 supercrítico, siguiendo el procedimiento experimental que se detallará en el Capítulo 4. El proceso se llevó a cabo a una temperatura de 313 K y una presión de 80 bar, obteniéndose un refinado constituido por aprox. 95% de cetonas (fundamentalmente ocimenonas). Este producto fue recuperado en acetona y almacenado en freezer a 263 K, protegido de la luz. En el momento de su utilización, se evaporó el solvente en un rotoevaporador. La composición cromatográfica del producto obtenido puede verse en la Tabla 1.9.

Tabla 1.9.

Perfil cromatográfico de la fracción de ocimenonas obtenida por fraccionamiento supercrítico de aceite de T. minuta

Componente % área E-ocimeno 4.35 dihidrotagetona 1.33 E-tagetona 2.75 Z-ocimenona 14.67 E-ocimenona 76.90

Los gorgojos fueron criados sobre granos enteros de maíz en condiciones controladas de temperatura (301–303 K) y humedad relativa (70–80%), en la oscuridad, a partir de una cepa obtenida en Metán, provincia de Salta (Argentina). En todos los experimentos se utilizaron adultos asexuados de 2 semanas de edad.

En los ensayos de actividad fumigante, se aplicaron distintas cantidades de aceite esencial o de cetonas puras sobre filtros de papel de 2 cm de diámentro, correspondientes a dosis de 15 a 600 l/l. Cada filtro de papel luego fue secado al aire por 2 minutos y colocado en la cara interna de la tapa roscada de un vial de vidrio (de 30 ml de volumen interno). Se colocaron 10 adultos de S. zeamais en cada vial, realizándose 5 réplicas por cada dosis ensayada. Los insectos de control se mantuvieron en las mismas condiciones, sin exposición a los aceites o cetonas puras. Se registró el porcentaje de mortalidad luego de 24 hs. para cada dosis y la concentración letal LC50.

En términos generales, tanto el aceite de T. minuta como la fracción de ocimenonas presentaron toxicidad fumigante frente al gorgojo S. zeamais. Sin embargo, como puede verse en la Tabla 1.10, el gorgojo es notablemente más sensible a la fracción de ocimenonas puras que al aceite completo.

Tabla 1.10.

Toxicidad fumigante en adultos de S. zeamais luego de 24 hs de exposición

Compuesto Concentración (l/l) % Mortalidad

Aceite de T. minuta 150 56.7 (5.8)

Ocimenonas 50 96.0 (8.9)

1 _{Cada valor representa el promedio de 5 réplicas, cada una con 10 adultos. Entre}

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En efecto, puede observarse que utilizando ocimenonas se obtiene una mortalidad notablemente mayor (96% versus 57%) que con el aceite completo, y con una concentración tres veces menor. Este resultado apoya las observaciones previamente reportadas que indican que estos compuestos son los principales responsables de la toxicidad del aceite frente a insectos.

La concentración letal LC50 del aceite de T. minuta frente a esta especie no pudo ser calculada, ya que la dependencia de la toxicidad con la dosis no evidenciaba un comportamiento lineal. Sin embargo, los resultados presentados permiten inducir que dicha LC50 estará ligeramente por debajo de los 150 l/l.

La Tabla 1.11, por su parte, muestra los resultados de toxicidad fumigante para la fracción de ocimenonas (en términos de % de mortalidad para una concentración dada, LC50 y LC95), comparativamente con las demás cetonas evaluadas, en orden decreciente de toxicidad.

Tabla 1.11.

Toxicidad fumigante de cetonas en adultos de S. zeamais luego de 24 hs de exposición

Compuesto % mortalidad

1

(a 50 l/l) (l/l) LC50 de confianza (l/l) Intervalo de 95% (l/l) LC95 de confianza (l/l) Intervalo de 95%

R-pulegona 100 (0)a 11.81 11.22 – 12.64 14.17 13.15 – 16.81 R-carvona 98.0 (4.47)a 17.56 15.17 – 19.88 28.75 25.59 – 33.91 S-carvona 82.0 (21.68)a 28.10 23.59 – 33.26 54.18 46.90 – 65.16 ocimenona 96.0 (8.9)a 42.30 37.87 – 47.55 56.86 50.59 – 73.32 -tuyona 30.0 (25.0)b 65.53 57.31 – 73.40 111.56 99.38 – 132.67 mentona 24.0 (11.22)b 85.46 72.15 – 97.95 164.49 146.31 – 191.88 1

Cada valor representa el promedio de 5 réplicas, cada una con 10 adultos. Entre paréntesis: desvío estándar. Valores con letras diferentes en la misma columna son significativamente diferentes entre sí de acuerdo al test de rango múltiple de Duncan para P ≤ 0.05.

Se observa que todas las cetonas evaluadas presentan actividad insecticida contra S. zeamais. Esto concuerda con las observaciones de otros autores que señalan a los componentes oxigenados en general (y a las cetonas en particular) como los principales responsables de la actividad tóxica que exhiben numerosos aceites esenciales [71]. Sin embargo, se pueden distinguir dos grupos. La pulegona, carvona y ocimenona presentan una toxicidad mayor, evidenciada en los altos valores de mortalidad (para una

concentración de 50 l/l), o en sus bajos valores de concentración letal, mientras que la - tuyona y la mentona exhiben un grado menor de efectividad.

  O   O O     (a) (b) (c)

*

*

Figura 1.8. Cetonas terpénicas insaturadas: (a) carvona, (b) pulegona, (c) ocimenona.

A partir de estos datos, puede señalarse que las cetonas más activas son las que presentan

insaturaciones, sugiriendo que esta característica estructural puede jugar un papel importante en la toxicidad. Se denomina insaturados a los compuestos que presentan un doble enlace C=C conjugado con respecto al grupo carbonilo, es decir, en el par de átomos de carbono inmediatamente adyacentes (denominados  y , en orden de alejamiento). Como puede verse en la Figura 1.8, la carvona, pulegona y ocimenona (y sus estereoisómeros) presentan esta característica química, a diferencia de la -tuyona y la mentona que son cetonas saturadas.

Los compuestos insaturados actúan como “aceptores de Michael”, en un tipo de reacción de adición en la que el doble enlace es atacado (generalmente en el carbono ) por grupos nucleofílicos, por ejemplo, de proteínas [72]. Se ha reportado que estos compuestos son potentes inhibidores de las enzimas glutatión-S-transferasas que participan en el metabolismo de xenobióticos, lo cual puede estar conectado con su mecanismo de toxicidad [73].

b) Actividad nematicida

El nemátodo Meloidogyne javanica (también llamado “nemátodo del nudo de la raíz”) es un parásito interno de las raíces de numerosas plantas, incluyendo cultivos de importancia agrícola, como la caña de azúcar, el olivo, la vid, el tomate, el tabaco, la soja, la papa, etc. [74].

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En este estudio, se evaluó la actividad nematicida de distintas fracciones del aceite de T. minuta con distinta composición cuantitativa (relación MT/OT), con el objetivo de correlacionar el grado de actividad con el contenido de cetonas.

Las fracciones ensayadas (E1–E4) fueron obtenidas a partir del aceite crudo mediante fraccionamiento con CO2 supercrítico, de manera similar al estudio descripto anteriormente. En este caso, en lugar de obtener una fracción de cetonas puras, se separaron varios cortes intermedios de distinta composición (32.8%, 54.4%, 82.4% y 95% de OT, respectivamente).

Los ensayos de actividad nematicida fueron realizados por la doctorando Yamile Massuh, quien estudia dicha especie en el marco de su tesis doctoral, dirigida por la Dra. Marta Ojeda y el Dr. Julio Zygadlo. Los ensayos se llevaron a cabo en el Instituto de Ciencias Agrarias (ICA) de Madrid, perteneciente al Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) durante una estancia de investigación bajo la dirección de las Dras. María Fé Andrés Yaves y Azucena Gonzáles Coloma. Los resultados aquí comentados se encuentran en proceso de publicación [75].

Se evaluó la toxicidad por contacto, aplicando sobre nemátodos jóvenes pequeñas alícuotas de cada fracción de aceite disueltas en DMSO y Tween 20, y registrando el porcentaje de letalidad para cada concentración.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 E1 E2 E3 E4 M o rt a li d a d ( % ) Fracción 1 mg/ml 0,5 mg/ml 0,25 mg/ml 0,125 mg/ml 0,0625 mg/ml 0,03125 mg/ml 0,015625 mg/ml Figura 1.9.

Mortalidad de fracciones de Tagetes minuta en nemátodos en función de la concentración ensayada. Contenido de cetonas insaturadas (principalmente ocimenonas):

Los resultados se muestran en la Figura 1.9. Allí puede observarse que la toxicidad aumenta en forma correlativa con el contenido de cetonas, para una misma concentración aplicada. Por ejemplo: para una concentración de 0.0625 mg/ml, la letalidad del extracto E1 (32.8% de cetonas) es menor al 10%, mientras que llega a ser superior al 85% para el extracto E4 (95% de cetonas). De este modo, en consecuencia, la utilización de extractos enriquecidos en cetonas permite obtener mayores niveles de toxicidad con concentraciones más bajas.