Una vez obtenido el cultivo puro, el paso siguiente para la identificación del microorganismo es la realización de una serie de pruebas de caracterización entre las que se incluyen: forma y disposición celular, tipo de metabolismo, propiedades tintoriales, etc.
1. Fermentación de azúcares
Fundamento: determina la capacidad de un microorganismo de fermentar (degradar) un hidrato de carbono específico incorporado a un medio básico, produciendo ácido, o ácido con gas visible.
Medio: para esta prueba se utiliza caldo nutritivo adicionado del hidrato de carbono a probar, el que se agrega en concentración del 1% para glucosa y disacáridos, y 0.5% para los demás glúcidos. Estos deben ser esterilizados por filtración o tyndalización. Envasar en tubos con campanita de Durham.
El medio debe ir adicionado con un indicador que puede ser: azul de bromo timol, rojo de fenol, etc., añadiéndose en razón de 1.25%.
Indicadores:
Rojo fenol...1 g Azul de bromo timol ...1 g NaOH N/10...40 ml NaOH N/10... 20 ml A.d. ...460 ml A.D. ...500 ml
Interpretación:
Cuando el indicador utilizado es azul de bromo timol, se considera: - POSITIVO
a) color amarillo: viraje hacia la zona ácida (A). b) Producción de gas, variable:
- positivo para gas (G). Se observan burbujas de gas en la campana de Durham. El desalojo de aproximadamente 1/3 de líquido basta para registrar la producción de gas. El microorganismo es aerogénico.
- negativo para gas: el microorganismo es anaerogénico (no se observan burbujas de gas).
- NEGATIVO
-Reacción retardada: color verde: no hay viraje del indicador. Volver a incubar 24 h más. 2. PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER – ROJO DE METILO
Para la realización de ambas pruebas se utiliza el medio de Clark y Lubs que es una solución buffer de peptona glucosada. K2HPO4...5 g Peptona...5 g Glucosa ...5 g A.D. c.s.p. ...1000 ml pH 7 – 7.2
Esterilizar la glucosa por separado. Sembrar. Incubar a 37°C durante 48-96 h.
2.a. Prueba de Voges Proskauer
Fundamento: se utiliza para determinar la capacidad de algunos microorganismos de producir un metabolito neutro, el acetil metil carbinol (acetoína), intermediario en la producción de 2,3- butanodiol a partir de la fermentación de glucosa por vía butilenglicólica.
Reacción de color: en presencia de O2 atmosférico y álcali, los productos finales neutros, acetoína y 2,3-butanodiol son oxidados a diacetilo. Este, en presencia de núcleos guanidina (que se encuentran en la peptona), el alfa-naftol y creatinina, produce compuestos de color rojo.
Reactivos: a) alfa naftol... 5 g alcohol 95°...1000 ml b) KOH ...40 g Creatina ...0.3 g A.D. ... 100 ml
A una alicuota de cultivo adicionar 0.2 ml de solución a), añadir a continuación 0.1-0.2 ml de solución b). Agitar.
Interpretación: -POSITIVO:
color rojizo oscuro en la superficie del medio indica la presencia de acetoína.
-NEGATIVO:
color amarillo en la superficie del medio (el mismo color del reactivo).
Precauciones:
- en caso de reacción negativa, se debe calentar suavemente. - El período de incubación del cultivo no debe exceder 3 días.
- Respetar el orden de agregado de los reactivos: primero alfa-naftol y luego KOH. La inversión puede dar resultados falsamente negativos.
- El volumen de KOH no debe exceder los 0.2 ml. El exceso podría ocultar una reacción débilmente positiva.
2.b. Prueba de Rojo de Metilo
Fundamento:
-Comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema.
-Es una prueba cualitativa de la producción de ácidos. Reacción de color:
La prueba de rojo de metilo se basa en el empleo de un indicador de pH, rojo de metilo, para determinar la concnentración de H+ (pH) presente cuando un organismo fermenta la glucosa por vía ácido-mixta.
El indicador señala los cambios en el grado de acidez por reacciones de color: pH = 4.4 ó menor, el reactivo se mantiene rojo.
pH = 5 a 5.8, diferentes tonos de anaranjado pH = 6, color amarillo
Reactivo:
Rojo de metilo... 0.1 g Alcohol...300 ml A.D. ...200 ml
A la otra porción del cultivo en Clark y Lubs, agregarle 2-3 gotas de la solución de rojo de metilo. Interpretación:
-POSITIVO: color rojo definido (pH 4.4) -NEGATIVO: color amarillo (pH 6)
-REACCION RETARDADA: color anaranjado. Continuar la incubación hasta 4 días y repetir la prueba.
Validez de la prueba:
La misma depende del tiempo de incubación, que debe ser de 2 a 5 días. Esto se basa en que a las 18-24 h todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae dan reacción positiva, y sólo aquellos
microorganismos rojo de metilo positivos continúan dando positiva la reacción a los 2-5 días de incubación.
3. PRUEBA DE UTILIZACION DEL CITRATO
Fundamento: permite determinar si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono para el metabolismo.
Algunas bacterias pueden suministrar energía en ausencia de fermentación o producción de ácido láctico, usando el citrato como única fuente de carbono, de acuerdo con la siguiente reacción:
citrato oxalacetato + formato oxalacetato piruvato + CO2
Los medios utilizados para la prueba de fermentación de citrato contienen también sales de NH4 inorgánicas, dado que un germen capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono también utiliza las sales de NH4 como única fuente de nitrógeno, desdoblando éstas a NH3 con producción de alcalinidad. El indicador azul de bromo timol señala el cambio de pH.
Medios utilizados:
-Medio citratado de Simmons
MgSO4...0.2 g NaCl...5.0 g NH4H2PO4 ...1.0 g Citrato de sodio ...2.0 g Azul de bromo timol al 1-2% ...3.0 ml Agua destilada c.s.p. ...1000 ml. Agar ...15.0 g Ajustar a pH = 6.8- 7.0, color del medio: verde
Se inocula por estrías 3nicamente sobre la porción inclinada del medio en pico de flauta. Incubación: 37°C durante 24-48 h.
Interpretación:
1. POSITIVO: crecimiento con viraje al azul intenso en el pico de flauta (a veces todo el medio).
2. NEGATIVO: no se observa crecimiento ni cambio de color del medio (permanece verde).