Para la obtención de células de MO se utilizaron ratones hembras de entre 6 y 10 semanas de edad de la cepa B6/SJL-PtprcaPep3b/BoyJ (Jackson Laboratory,
Sacramento, CA,EEUU; en adelante nos referiremos a esta cepa como B6/SJL), criada y mantenida en el estabulario del VHIR. Se estabularon en salas con temperatura controlada (20-22º C) y con ciclos de luz-oscuridad de 12 h. Los animales se
99 mantuvieron y manipularon según la normativa nacional y europea y con la aprobación del Comitè Ètic d’Experimentació Animal (CEEA) del VHIR.
Como ratones receptores se utilizaron hembras de entre 6 y 10 semanas de edad de la cepa C57BL/6J (Harlan Laboratories, Lesmo MB, Italia). A su llegada, se distribuyeron en grupos de 5 ó 10 ratones por jaula en racks ventilados y permanecieron en cuarentena durante un período mínimo de una semana. Las dos cepas son congénicas, es decir, comparten idéntico MHC (H-2b) pero tienen distintas variantes alélicas del gen que codifica para la molécula CD45 (CD45.1 para la cepa donante y CD45.2 para la cepa receptora), que se expresa exclusivamente en las células nucleadas de origen hematopoyético, de forma que tras un trasplante hematopoyético las células del donante pueden diferenciarse de las del receptor mediante un simple marcaje con anticuerpos monoclonales específicos para una u otra variante alélica.
3.2. Obtención de células de la médula ósea
A los ratones donantes se les administró una dosis de 100 mg/kg de 5-fluorouracilo (5-FU; Ferrer Farma, Barcelona, España) en suero fisiológico por vía intraperitoneal (i.p.). Este tratamiento elimina las células que están en división, enriquece en progenitores hematopoyéticos inmaduros (más quiescentes) y a su vez los induce a dividirse, condición indispensable para poder ser transducidos con vectores retrovirales.
A los cinco días de la administración del 5-FU, los ratones se sacrificaron mediante asfixia por CO2. Seguidamente se procedió a la esterilización con etanol al 70% de la zona ventral de los animales y a su disección para extraerles ambas tibias, fémures y crestas ilíacas, limpiando los huesos de los tejidos adyacentes. Una vez extraídos, se mantuvieron en frío y se colocaron en un tubo de 50 ml (NUNC, Roskilde, Dinamarca) conteniendo 10 ml de medio IMDM (PAA) suplementado con:
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• 20% FCS Gold
• 2 mM de L-glutamina • 50 UI/ml penicilina
• 50 µg/ml de estreptomicina
Trabajando en cabina de flujo laminar vertical, los huesos desprovistos de tejidos adyacentes se colocaron en un mortero estéril con 6 ml de medio IMDM suplementado y se machacaron con suavidad con la mano de mortero. Se procedió a recoger las células en un tubo de 50 ml filtrándolas previamente con un filtro de nylon de 70 µm (BD, San Jose, CA, EEUU). Después de varios lavados con medio IMDM para recoger las células liberadas del hueso, se centrifugaron 5’ a 453 g y se procedió a su contaje en una cámara de Neubauer usando solución de Türk (Merk-Millipore, Darmstadt, Alemania) como diluyente. Esta solución contiene colorante Giemsa y un 1% de ácido acético que permite el lisado de los eritrocitos y facilita el contaje de las células nucleadas. También se evaluó la viabilidad utilizando el colorante azul de tripano (Sigma Aldrich, Saint Louis, MI, EEUU) (0,4% azul de tripano en suero fisiológico) y contando el número de células vivas (que no incorporan el colorante) y muertas (que sí lo incorporan).
3.3. Transducción de las células de la MO
a. Tratamiento de las placas de cultivo con RetroNectin®
Con el fin de mejorar la eficiencia de transducción, antes de sembrar las células en las placas de cultivo de 6 pocillos (NUNC) estas se incubaron con 1 ml de solución de RetroNectin® (fragmento recombinante CH-296 de la fibronectina (Takara Shuzo, Co., LTD, Kyoto, Japón) diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 48 µg/ml) durante 2 h a temperatura ambiente. Una vez retirada la solución que contenía el CH-296, las placas se incubaron durante 30’ a temperatura ambiente con PBS y albúmina sérica bovina (BSA; Sigma Aldrich) al 2%. Finalmente, se lavaron con 1 ml de solución salina tamponada de Hank (HBSS, PAA) que contenía 25 mM de tampón Hepes (PAA).
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b. Preestimulación de las células de la MO con citocinas
Las células de la MO se cultivaron en placas de 6 pocillos pretratadas como se describe en el apartado anterior a una concentración de 106 CMN por ml en un volumen final de 2 ml. El medio utilizado para este tipo de cultivo fue IMDM suplementado con:
• 20% FCS Gold
• 2 mM de L-glutamina • 50 UI/ml de penicilina • 50 µg/ml de estreptomicina
• 10% de medio condicionado de la línea celular WEHI-3B, como fuente de IL-3 murina (Lee et al. 1982).
• 8% de medio condicionado de la línea celular BHK/MKL (baby
hamster kidney / murine kit ligand), como fuente de factor de crecimiento de células madre murino (mSCF) y cedida por S. Tsai (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, EEUU).
* De forma alternativa se utilizaron citocinas murinas recombinates: mSCF, mIL3, mTPO, mFlt3 (Immunotools, Friesoythe, Alemania), todas a una concentración de 10 ng/ml.
La preestimulación con citocinas se llevó a cabo durante 48 h en un incubador a 37ºC, 5% CO2 y 100% de humedad relativa con la finalidad de estimular a las células progenitoras a dividirse y prevenir su apoptosis.
c. Obtención del sobrenadante rico en vectores recombinantes
Las líneas productoras de retrovirus recombinantes NX-e/Ii7 y NX-e/IiMOG23 se descongelaron siguiendo las técnicas estándares de descongelación. Se cultivaron en medio DMEM suplementado y se mantuvieron en cultivo, como se especifica en el apartado 2 de esta misma sección. Cuando llegaron a confluencia, se subcultivaron en un frasco de cultivo de volumen adecuado para poder obtener el volumen de
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sobrenadante necesario para la transducción. El día previo a la recogida del sobrenadante rico en vectores se cambió el medio habitual de crecimiento de las líneas productoras de vectores por el medio adecuado para el cultivo de las células diana a transducir (ver apartado 2.3.2, pero sin añadir los medios condicionados de las líneas celulares WEHI-3B y BHK/MKL). A las 16-18 h se recogió el sobrenadante y se filtró (0,45 µm) para evitar el posible paso de células productoras de vectores. Los sobrenadantes se usaron inmediatamente o se alicuotaron y criopreservaron a -80ºC hasta que hubo necesidad de utilizarlos.
d. Transducción de las células de la médula ósea con vectores retrovirales
Se realizaron dos ciclos de transducción en dos días consecutivos usando una multiplicidad de infección (MOI) aproximada de entre 1 y 2 en cada ciclo (Figura 21). Se recogió el 90% del volumen de medio de cada pocillo en un tubo de 50 ml y se centrifugó 5’ a 453 g a 4º C. El pellet celular se resuspendió en la siguiente mezcla:
• 10% de medio condicionado WEHI-3B • 8% de medio condicionado BHK/MKL • 4 µg/ml de sulfato de protamina
• 82% de sobrenadante de la línea productora de retrovirus En cada pocillo se restauró el volumen con medio rico en vectores en el que se resuspendieron las células que se habían recogido. Las placas se centrifugaron a 652 g durante 1 h a 32º C. Al día siguiente se repitió este mismo procedimiento.
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Figura 21 - Esquema de la obtención y transducción de la MO murina. Ver texto. 5-FU: 5-fluorouracilo; MC: medio condicionado.
3.4. Recuperación de las células de MO cultivadas
Transcurridas 24 h desde el segundo ciclo de transducción, las células en cultivo se despegaron del plástico usando CellDissociationBuffer Enzyme-free PBS-based (Gibco BRL, Paisley, Reino Unido) y se recogieron en un tubo de 50 ml. Después de lavarlas con PBS, se contaron en una cámara de Neubauer diluyéndolas en solución de Türk y se evaluó la viabilidad con azul de tripano como ya se ha descrito anteriormente. A continuación fueron incubadas en 10 UI de DNAsa (Sigma Aldrich) por cada 106 CMN durante 15’ a 25ºC. Después de lavarlas se resuspendieron en el volumen adecuado de PBS para finalmente realizar los ensayos funcionales que se describen a continuación, separación celular o inyectarlas i.v. por la vena lateral de la cola (ver apartado 10).